探讨DNA甲基化检测在绝经后女性子宫内膜癌筛查中的应用价值。
选取2020年5月至2021年10月就诊于北京协和医院妇产科、可疑内膜病变、拟行宫腔镜检查的绝经女性143例，术前收集宫颈脱落细胞进行基因甲基化检测。同时收集患者基本临床信息、生物标记物与经阴道超声（TVS）的子宫内膜厚度等。以宫腔镜下内膜组织病理学诊断为金标准，采用多因素logistic回归模型分析子宫内膜癌的相关因素，利用受试者工作特征（ROC）曲线下的面积（AUC）重点分析基因甲基化检测联合或不联合超声检查对绝经后妇女子宫内膜癌的筛查效能。
143例患者分为内膜癌组（56例）和对照组（87例），年龄分别为（59.27±6.45）和（61.07±8.26）岁（P=0.051）。多因素分析发现，CA125≥35 U/ml、绝经出血、绝经内膜厚度≥5 mm、CDO1甲基化（ΔCt≤8.4）、CELF4甲基化（ΔCt≤8.8）是发生子宫内膜癌的相关因素，OR值（95%CI）分别为33.23（2.51~1 335.28）、8.41（1.81~39.05）、14.45（2.35~88.84）、17.34（3.34~89.98）、44.01（6.79~285.25），均P<0.05。双基因甲基化（CDO1 ΔCt≤8.4或CELF4 ΔCt≤8.8）诊断内膜癌的灵敏度、特异度最高，分别为87.5%（95%CI：75.9%~94.8%）和90.8%（95%CI：82.7%~95.9%）。TVS联合DNA甲基化检测可进一步提高灵敏度，为100.0%（95%CI：93.6%~100.0%），但不能改善特异度，为59.8%（95%CI：48.8%~70.1%）。
对于绝经后女性宫颈细胞学DNA甲基化筛查内膜癌的准确性优于其他无创临床方案。联合TVS可以改善筛查的敏感性。
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子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤，全球和我国每年新发分别达到41.74万和7.11万例，每年死亡病例9.7万和1.71万［1, 2］。早期识别高危患者及癌前病变、实现癌症早筛、有效检测癌症进展和治疗，是当前内膜癌诊疗领域的重大课题之一［3］。对于绝经后出血、子宫内膜厚度超过4 mm的患者，仅有8%的患者存在内膜增生和内膜癌［4］；反复绝经后出血的患者中内膜病变的比例仅提升到9%［5］。内膜癌评估主要依赖于有创性操作，如诊断性刮宫、宫腔镜检查、宫腔细胞学和病理学微量检测等，但漏诊率较高。目前国内外都没有可用于临床实践的、无创性筛查方案推荐［6, 7］。
抑癌基因的表观遗传学沉默对于癌症发生和进展有重要作用［8, 9, 10］。已有大量有关内膜癌发生发展的甲基化研究，最新研究表明通过宫颈脱落细胞的自采集可以改善内膜癌的早期诊断［11, 12］。研究者已经申请了多项宫颈细胞学甲基化检测用于内膜癌的临床试验，开发了相应的试剂盒（NCT03744962、NCT04651738、NCT05290922和NCT05290415）。基于这些工作，本研究在队列研究中，应用宫颈脱落细胞中CDO1基因甲基化（CDO1m）和CELF基因甲基化（CELF4m）检测对可疑内膜病变的绝经后女性进行筛查，并探索细胞学甲基化联合或不联合经阴道超声（transvaginal ultrasound，TVS）的准确性。
本研究为横断面研究。以2020年5月至2021年10月在北京协和医院妇科门诊就诊、怀疑内膜病变、拟行宫腔镜检查的患者作为研究对象。纳入标准：年龄≥40岁，基于《绝经管理与绝经激素治疗中国指南（2018）》［13］、根据临床表现和检查考虑为绝经后女性；根据《子宫内膜癌筛查规范》［6］建议怀疑内膜病变或由临床医师建议进行宫腔镜检查及活检；既往未因内膜病变接受过任何治疗或手术治疗；愿意接受检测并签署知情同意书；宫腔镜前评估未发现浸润性宫颈癌。本研究通过了北京协和医院伦理委员会审批（批号：ZS-2740），接受检测前患者均签署相关知情同意书。
宫颈脱落细胞学的样本来自患者术前进行传统细胞学检查和（或）高危人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）检测的剩余样本总计2 ml。患者的宫腔镜检查由北京协和医院具有资质的术者在静脉麻醉下完成，根据病情对内膜及病变进行活检、切除或诊断性刮宫。患者宫颈细胞学和HPV检测以及组织病理评估由研究者完成并进行复核。
患者与内膜癌发病相关的一般情况和临床表现由专门的病例收集表采集。本研究重点关注如下与内膜癌相关的临床指标与检查结果，包含年龄、绝经状态、孕产次、既往病史、体质指数（body mass index，BMI）、宫腔镜前1个月内经TVS评估内膜厚度以及宫腔镜前1个月内的糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）数值。结合病史和临床表现，基于国内指南判断是否存在多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）病史［14］。在本研究中，定义TVS评估的阳性发现为内膜厚度≥5 mm（绝经后）。血清CA125≥35 U/ml定义为异常。根据国内指南［15］定义异常子宫出血或绝经后阴道流血。
实验样本均为参与者进行宫颈癌筛查后残留的宫颈细胞学样本2 ml。在获得患者知情同意的情况下，进行样本采集。细胞离心分离后利用细胞DNA提取试剂盒进行宫颈脱落细胞DNA提取，利用DNA重亚硫酸盐转化试剂盒处理提取后的核酸，转化完成的DNA（Bis-DNA）立即进行PCR检测。按照“人CDO1和CELF4基因甲基化检测试剂盒（PCR-荧光探针法）”（NCT05290922，北京起源聚禾生物科技有限公司）产品说明书进行操作［16］。使用SLAN-96S全自动医用PCR分析系统或ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，反应条件：预变性96 ℃/10 min；45个循环，变性94 ℃/15 s，退火64 ℃/5 s，延伸、荧光采集60 ℃/30 s；仪器冷却25 ℃/1 min。反应结束后根据CDO1基因、CELF4基因与内参基因的Ct值，计算ΔCt（ΔCt=Ct检测基因-Ct内参基因）；甲基化判断标准阳性采用Youde指数计算方案。
采用SPSS 26.0统计软件包进行统计分析。计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ²检验。符合正态分布的计量资料用表示，两组间比较采用t检验。非正态分布的计量资料用M（Q1，Q3）表示，两组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验。采用多因素logistic回归模型分析子宫内膜癌发生的相关因素。利用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线下面积（area under curve，AUC）评估各指标诊断子宫内膜癌的效果，并计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、OR值及其各自的95%CI。双侧检验，检验水准α=0.05。
143例患者分为内膜癌组（56例）和对照组（87例），年龄分别（59.27±6.45）和（61.07±8.26）岁（P=0.051）。其中对照组包含良性80例，内膜增生3例，其他癌症4例。2组临床特征的比较见表1。
子宫内膜癌组与对照组患者临床特征比较
子宫内膜癌组与对照组患者临床特征比较
| 项目 | 子宫内膜癌 组（n=56） | 对照组 （n=87） | t/χ²值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁，） | 59.27±6.45 | 61.07±8.26 | 1.64 | 0.051 |
| BMI（kg/m2，） | 26.62±4.24 | 24.32±3.16 | 1.80 | 0.014 |
| BMI≥25 kg/m2［例（%）］ | 35（62.5） | 33（37.9） | 7.29 | 0.006 |
| 孕次［例（%）］ | 7.18 | 0.023 | ||
| 0 | 2（3.6） | 3（3.4） | ||
| 1~2 | 37（66.1） | 38（43.7） | ||
| ≥3 | 17（30.4） | 46（52.9） | ||
| 产次［例（%）］ | 2.13 | 0.560 | ||
| 0 | 5（8.9） | 3（3.4） | ||
| 1 | 39（69.6） | 63（72.4） | ||
| 2 | 9（16.1） | 17（19.5） | ||
| 3 | 3（5.4） | 4（4.6） | ||
| 糖尿病［例（%）］ | 9（16.1） | 10（11.5） | 0.29 | 0.457 |
| PCOS史［例（%）］ | 21（37.5） | 36（41.4） | 0.08 | 0.727 |
| 合并肌瘤［例（%）］ | 13（23.2） | 29（33.3） | 0.27 | 0.259 |
| 合并腺肌症［例（%）］ | 7（12.5） | 5（5.7） | 0.64 | 0.217 |
| CA125≥35 U/ml［例（%）］ | 22（39.3） | 8（9.2） | 13.30 | <0.001 |
| 绝经后出血［例（%）］ | 48（85.7） | 25（28.7） | 42.01 | <0.001 |
| 内膜厚度≥5 mm［例（%）］ | 43（76.8） | 30（34.5） | 22.74 | <0.001 |
| CDO1m（ΔCt）≤8.4［例（%）］ | 42（75.0） | 5（5.7） | 70.95 | <0.001 |
| CELF4m（ΔCt）≤8.8［例（%）］ | 44（78.6） | 4（4.6） | 80.32 | <0.001 |
注：BMI为体质指数；PCOS为多囊卵巢综合征；CA125为糖类抗原125；CDO1m为CDO1基因甲基化；CELF4m为CELF4基因甲基化
多因素分析发现，CA125≥35 U/ml、绝经出血、绝经内膜厚度≥5 mm、CDO1mΔCt≤8.4、CELF4mΔCt≤8.8（基于Youde指数）是发生子宫内膜癌的相关因素，OR值（95%CI）分别为33.23（2.51~1 335.28）、8.41（1.81~39.05）、14.45（2.35~88.84）、17.34（3.34~89.98）、44.01（6.79~285.25），均P<0.05。详见表2。
与子宫内膜癌发生相关临床指标的多因素logistic回归模型分析
与子宫内膜癌发生相关临床指标的多因素logistic回归模型分析
| 项目 | β值 | SE值 | Wald χ2值 | P值 | OR值（95%CI） |
|---|---|---|---|---|---|
| BMI（kg/m2） | |||||
| <25 | 1.00 | ||||
| ≥25 | 0.315 | 0.819 | 0.384 | 0.701 | 1.15（0.20~6.74） |
| CA125（U/ml） | |||||
| <35 | 1.00 | ||||
| ≥35 | 2.526 | 1.045 | 2.418 | 0.022 | 33.23（2.51~1 335.28） |
| 绝经后出血 | |||||
| 否 | 1.00 | ||||
| 是 | 2.772 | 1.020 | 2.718 | 0.007 | 8.41（1.81~39.05） |
| 内膜厚度（mm） | |||||
| <5 | 1.00 | ||||
| ≥5 | 2.809 | 1.051 | 2.673 | 0.004 | 14.45（2.35~88.84） |
| CDO1m（ΔCt） | |||||
| >8.4 | 1.00 | ||||
| ≤8.4 | 2.686 | 1.077 | 2.494 | 0.001 | 17.34（3.34~89.98） |
| CELF4m（ΔCt） | |||||
| >8.8 | 1.00 | ||||
| ≤8.8 | 4.011 | 1.098 | 3.654 | <0.001 | 44.01（6.79~285.25） |
注：BMI为体质指数；CA125为糖类抗原125；CDO1m为CDO1基因甲基化；CELF4m为CELF4基因甲基化
子宫内膜癌组患者的内膜厚度为9.5（5.0，12.0）mm，高于对照组的3.2（2.0，6.0）mm（Z=-5.10，P<0.001）。子宫内膜癌组患者基因CDO1m水平ΔCt值为5.2（2.5，8.4），低于对照组的17.4（14.6，18.2）（Z=-7.97，P<0.001），而子宫内膜癌组患者基因CELF4m水平ΔCt值为4.9（3.2，8.5），低于对照组的16.4（10.9，17.9）（Z=-8.17，P<0.001）。
各临床指标筛查内膜癌的ROC曲线见图1。内膜厚度≥5 mm、CDO1m（+）、CELF4m（+）以及双基因甲基化（+）的AUC（95%CI）分别为0.71（0.64~0.80）、0.85（0.77~0.92）、0.87（0.80~0.94）和0.89（0.83~0.95）。超声检查（+）或双基因甲基化（+）的AUC（95%CI）为0.80（0.73~0.87）。
注：双基因甲基化：CDO1m（+）或CELFm（+）；内膜厚度和双基因甲基化：两种检测皆为阳性判为最终阳性；子宫内膜厚度或基因甲基化：两种检测任一阳性判为最终阳性；CDO1m为CDO1基因甲基化；CELF4m为CDLF4基因甲基化
子宫内膜癌筛查指标的临床效能见表3。CDO1m与CELF4m双基因联合灵敏度为87.5%（95%CI：75.9%~94.8%），特异度为90.8%（95%CI：82.7%~95.9%），阳性预测值为86.0%（95%CI：75.8%~92.3%），阴性预测值为91.9%（95%CI：84.9%~95.8%）。以TVS子宫内膜厚度联合双基因甲基化诊断子宫内膜癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为100.0%（95%CI：93.6%~100.0%）、59.8%（95%CI：48.7%~70.1%）、61.5%（95%CI：55.3%~67.4%）、100.0%（95%CI：93.2%~100.0%）。
子宫内膜癌筛查指标的临床效能（95%CI）
子宫内膜癌筛查指标的临床效能（95%CI）
| 项目 | 灵敏度（%） | 特异度（%） | 阳性预测值（%） | 阴性预测值（%） | AUC |
|---|---|---|---|---|---|
| 出血 | 85.7（73.8~93.3） | 71.3（60.6~80.5） | 65.8（57.6~73.1） | 88.6（80.1~93.7） | 0.79（0.71~0.86） |
| 内膜厚度 | 76.8（63.6~87.0） | 65.5（54.6~75.4） | 58.9（50.9~66.5） | 81.4（72.7~87.8） | 0.71（0.64~0.80） |
| CDO1m（+） | 75.0（61.6~85.6） | 94.3（87.1~98.1） | 89.4（78.0~95.2） | 85.4（78.8~90.2） | 0.85（0.77~0.92） |
| CELF4m（+） | 78.6（65.6~88.4） | 95.4（88.6~98.7） | 91.7（80.7~96.7） | 87.4（80.7~92.0） | 0.87（0.80~0.94） |
| 双基因甲基化（+） | 87.5（75.9~94.8） | 90.8（82.7~95.9） | 86.0（75.8~92.3） | 91.9（84.9~95.8） | 0.89（0.83~0.95） |
| 超声检查（+）/双基因甲基化（+） | 100.0（93.6~100.0） | 59.8（48.7~70.1） | 61.5（55.3~67.4） | 100.0（93.2~100.0） | 0.80（0.73~0.87） |
注：AUC为受试者工作特征曲线下面积；CDO1m为CDO1基因甲基化；CELF4m为CELF4基因甲基化
本研究首次以宫颈脱落细胞学基因甲基化检测的无创液体活检方案对绝经后女性进行内膜癌筛查，获得了高于其他任何无创检测方案的准确性。基因甲基化联合TVS检查进一步提高了对内膜癌筛查的灵敏度，证实了这种无创筛查方案在临床应用中的价值。研究选择了绝经后可疑内膜病变的女性入组，一是这一人群中内膜病变的发生率最高，从而可以以较小的队列规模实现各种筛查方案检验效能的比较；二是可以充分检验临床症状（绝经后出血）对于筛查诊断内膜癌的效能。
选择宫颈脱落细胞DNA甲基化检测进行内膜癌的筛查诊断是本研究的重要创新。已有研究开展了脱落细胞用于细胞病理分析［17］、内膜癌靶基因检测［18］、遗传综合征确诊［19］、外泌体分析［20］、MSI检测［21］以及多组学检测［22］。但还没有开展脱落细胞表观遗传学分析的相关研究，更没有应用于临床的可靠筛查方案。另一方面，利用血液ctDNA进行内膜癌检测的工作因为肿瘤细胞丰度不足，缺少充分的敏感性，仅适合内膜癌中的少数情况，如高级别内膜癌（占内膜癌不足10%的Ⅱ型内膜癌）、晚期内膜癌等［23］，并不适合进行内膜癌的早筛早诊。宫颈脱落细胞用于内膜癌筛查和诊疗具有很多突出优点：（1）完全无创。除了没有性生活的女性外，取样不会对阴道、宫颈造成任何损害，比留取外周血还要简便、安全；（2）取材方便。准确性完全不亚于医师或检测者取样的结果［24］；（3）细胞量充分。少许的阴道冲洗液就完全能够胜任甲基化检测，并与组织学结果高度一致［16］。
宫颈脱落细胞学用于内膜癌筛查需要选择可靠的靶基因，以区分阳性结果的癌肿特异性，即筛查结果提示宫颈癌还是内膜癌。如果是内膜癌，能否考虑纳入不同类型的内膜癌。研究已经表明，选择合适的靶基因是可以实现区分的［25］。已有研究利用宫颈脱落细胞学对内膜和宫颈细胞进行区分，并开展了内膜细胞外泌体及代谢组学的工作。宫颈脱落细胞评估内膜病变的准确性不亚于有创操作获得的宫腔细胞学（或冲洗液）［26］。本研究中选择的靶基因CDO1和CELF4表观遗传改变与内膜癌的关系已经获得文献支持［27］。
TVS以无创、经济、易操作的优点成为绝经后女性子宫内膜疾病临床诊断首选的筛查方法［28］。TVS对于筛查内膜癌敏感度高，但特异度低，常常造成不必要的有创操作。本研究中，细胞学甲基化检测在联合TVS后，可以进一步改善对内膜癌筛查敏感性。但由于TVS的特异性过低，二者的联合检测未能实现更高水平的特异性。如果结合TVS，将牺牲部分特异性、增加有创操作的可能。这种情况能否重复和改善，仍需大队列研究的证实。
本研究最具创新意义的价值在于采用细胞学甲基化检测用于内膜癌的筛查。本研究也存在一些缺点，包括总体样本量小亟需在大队列中进行推广等问题。这将在研究者开展的大规模多中心前瞻性研究（NCT05290415）中进一步满足和弥补。
总之，研究通过宫颈脱落细胞学DNA甲基化，为绝经后女性的内膜癌筛查提供了一种简便、无创、高敏感性的筛查方案，亟待在大规模临床研究中进一步验证。
孔令华, 肖晓萍, 万茹, 等. DNA甲基化检测在绝经后女性子宫内膜癌筛查中的应用价值[J]. 中华医学杂志, 2023, 103(12): 907-912. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20220929-02058.
北京起源聚禾生物科技有限公司提供的甲基化分析试剂盒
所有作者均声明不存在利益冲突
