探讨中国肝癌的分期方案（CNLC）Ⅱb、Ⅲa期可切除性肝细胞癌患者术前接受免疫检查点抑制剂联合抗血管生成靶向药物新辅助治疗的安全性及有效性。
回顾性分析2018年1月至2020年12月于南京医科大学第一附属医院肝胆中心经手术切除的129例CNLC Ⅱb、Ⅲa期肝细胞癌患者的资料。按照是否接受新辅助治疗分为两组，新辅助组14例患者，男性13例，女性1例，年龄（55.4±12.6）岁（范围：34~75岁），术前接受免疫联合靶向治疗，免疫检查点抑制剂为卡瑞利珠单抗（200 mg静脉滴注，每2周1次，连续使用3次），抗血管生成靶向药物为阿帕替尼（250 mg口服，1次/d，连续服用3周）；常规手术组115例患者，男性103例，女性12例，年龄（55.8±12.0）岁（范围：21~83岁），术前未接受抗肿瘤治疗。新辅助组中，CNLC Ⅱb期3例，CNLC Ⅲa期11例；常规组中，CNLC Ⅱb期28例，CNLC Ⅲa期87例。定量资料的组间比较采用t检验或秩和检验，定性资料的组间比较采用Fisher确切概率法，采用Log-rank检验比较不同组别间的生存差异。
新辅助组患者的1年复发率为42.9%，常规组为64.0%，差异有统计学意义（Log-rank检验：χ²=3.850，P=0.050）；新辅助组患者的1年生存率为100%，常规组为74.2%，差异有统计学意义（χ²=5.170，P=0.023）。按肿瘤数目分层分析，新辅助组中单发肿瘤患者的1年复发率为25.0%，常规手术组为71.0%，两组差异有统计学意义（χ²=5.280，P=0.022）；新辅助组中多发肿瘤患者的1年复发率为66.7%，常规手术组为58.9%，两组差异无统计学意义（χ²=0.110，P=0.736）。新辅助组和常规组患者的手术时间、术中出血量、术中输血量、术后住院时间和术后并发症发生率等的差异均无统计学意义（P值均>0.05）。
免疫检查点抑制剂联合抗血管生成靶向药物作为可切除性肝细胞癌的新辅助方案，可降低肿瘤的术后1年复发率，提高患者的1年生存率，尤其适用于单发病灶的患者。受限于新辅助组的样本量，无法更全面地观察免疫联合靶向治疗的安全性，留待后期进一步研究。
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据全球癌症数据统计，2020年新增肝癌患者约90万例，死亡约83万例，肝癌目前已经成为全球第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因。而中国肝癌新发病例约占全球的45.3%，死亡病例约占47.1%［1］。令人惋惜的是，中国肝癌患者的5年生存率仅为12.1%［2］，虽然经过手术治疗的肝癌患者5年生存率可提高至60%［3］，但Ⅱb和Ⅲa期可切除的肝癌患者术后1年复发率超过55%［3］。因此，如何降低这些患者术后的高复发率，成为肝癌治疗的热点和难点。
胃癌、肠癌的术前新辅助治疗已被证实可明显降低术后复发率并延长生存期，但目前肝细胞癌尚缺乏公认的新辅助治疗方案。近年来，以程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）单抗为代表的免疫检查点抑制剂和抗血管生成靶向药物联合治疗成为中晚期肝细胞癌的一线系统治疗方案。本中心开展了一项单臂二期免疫新辅助治疗肝细胞癌的临床试验［卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼围手术期治疗可切除肝细胞癌有效性和安全性研究（NCT04297202）］，该研究结果证实术前靶免新辅助治疗可降低肝癌术后复发率，且患者耐受性良好，未出现围手术期严重不良事件［4］。最近另外两个团队亦报告了肝细胞癌免疫新辅助治疗的二期临床实验［5, 6］，这两项新辅助方案采用的是免疫单药（PD-1单抗）和双免疫（PD-1单抗联合CTLA-4单抗），均取得较好效果。但这3项研究均为单臂研究，缺乏对照组。
本研究回顾性分析了我院肝胆中心2018年1月至2020年12月收治的129例手术切除的中国肝癌的分期方案（China liver cancer staging，CNLC）Ⅱb、Ⅲa期肝细胞癌患者的病历资料，以比较免疫新辅助组和常规手术组的有效性及安全性。
回顾性收集2018年1月至2020年12月我院肝胆中心收治的接受肝切除的152例Ⅱb、Ⅲa期肝细胞癌患者资料。
本研究的纳入标准：（1）临床诊断、组织学检查或细胞学检查诊断为肝细胞癌；（2）年龄≥18岁；（3）CNLC Ⅱb期或Ⅲa期，且全部病灶可切除（术中可结合射频消融术）；（4）东部肿瘤协作组体力状态评分为0~1分；（5）主要器官功能基本正常；（6）入组治疗前无抗肿瘤治疗病史；（7）经病理学检查证实切缘为阴性（R0切除）。排除标准：（1）肝内胆管癌、混合性肝癌、肉瘤样肝癌或肝纤维板层癌；（2）近5年内有除肝细胞癌以外的恶性肿瘤；（3）正在或曾经接受器官移植或同种异体骨髓移植；（4）有临床症状的中度至重度腹水需要引流；（5）患者入组前6个月内有胃肠道出血史，或有胃肠道出血倾向、腹腔瘘、胃肠道穿孔、腹腔脓肿。
根据纳入和排除标准，共129例患者纳入本研究，其中新辅助组14例［CNLC Ⅱb期3例、CNLC Ⅲa期11例，年龄（55.4±12.6）岁（范围：34~75岁）］，常规手术组115例［CNLC Ⅱb期28例、CNLC Ⅲa期87例，年龄（55.8±12.0）岁（范围：21~83岁）］。两组患者的一般资料见表1。
新辅助组和常规手术组肝细胞癌患者一般资料比较
新辅助组和常规手术组肝细胞癌患者一般资料比较
| 组别 | 例数 | 年龄（岁） | 性别（例） | 肝炎病史（例） | 慢性 病史（例） | 就诊时有 症状（例） | 血小板计数 （×109/L） | 白蛋白 （g/L） | ALT （U/L） | AST （U/L） | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 男 | 女 | 无 | 乙肝 | 丙肝 | |||||||||
| 新辅助组 | 14 | 55.4±12.6 | 13 | 1 | 2 | 11 | 1 | 5 | 3 | 188（185） | 35.4±2.6 | 47.7（41.0） | 64.9（40.9） |
| 常规手术组 | 115 | 55.8±12.0 | 103 | 12 | 5 | 107 | 3 | 34 | 58 | 152（104） | 37.9±4.4 | 38.9（29.7） | 44.5（31.9） |
| 统计值 | - | t=0.101 | - | - | - | - | Z=0.722 | Z=2.306 | Z=1.748 | Z=1.542 | |||
| P值 | - | 0.920 | 1a | 0.126 a | 0.759 a | 0.049 a | 0.471 | 0.021 | 0.080 | 0.123 | |||
| 组别 | 总胆红素 （μmol/L） | 甲胎蛋白 （μg/L） | 腹水 （例） | 肝硬化 （例） | 肝脏 萎缩（例） | Child-Pugh分级（例） | 肿瘤 最大径（cm） | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A级 | B级 | |||||||
| 新辅助组 | 12.3（0.9） | 32.8（623.0） | 1 | 9 | 3 | 13 | 1 | 9.2（7.8） |
| 常规手术组 | 14.8（9.2） | 395.2（1 185.5） | 21 | 97 | 15 | 95 | 20 | 7.5（5.5） |
| 统计值 | Z=3.134 | Z=1.980 | - | - | - | - | Z=0.603 | |
| P值 | 0.002 | 0.048 | 0.462a | 0.130 a | 0.414 a | 0.465 a | 0.547 | |
| 组别 | 肿瘤分化程度（例） | 脉管 癌栓（例） | 肿瘤数目（例） | 肿瘤突破肝被膜（例） | 中国肝癌的分期方案（例） | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 高 | 中 | 低 | 缺失 | 单发 | 多发 | 未突破 | 紧邻肝被膜 | Ⅱb期 | Ⅲa期 | ||
| 新辅助组 | 3 | 4 | 5 | 2 | 12 | 8 | 6 | 10 | 4 | 3 | 11 |
| 常规手术组 | 24 | 45 | 43 | 3 | 104 | 50 | 65 | 55 | 60 | 28 | 87 |
| 统计值 | - | - | - | - | - | ||||||
| P值 | 0.218 a | 0.633 | 0.399 a | 0.155 a | 1 a | ||||||
注：表内符合正态分布的定量资料以表示，不符合正态分布的定量资料以M（IQR）表示；a示Fisher确切概率法检验得到的P值；-示无数据
本研究符合《赫尔辛基宣言》要求，患者及家属均签署相关治疗的知情同意书。
新辅助组患者静脉滴注卡瑞利珠单抗200 mg，每2周1次，连续使用3次；口服阿帕替尼250 mg，1次/d，连续3周，6周后行手术切除。本方案经我院伦理委员会审批（审查号：2019-SR-332）。
手术后并发症采用Clavien-Dindo并发症分级系统［7］及国际肝脏外科研究组术后肝功能衰竭分级标准进行评估［8］。按照术后2年内每6个月1次，2年后每年1次的频率随访患者。采用电话随访与门诊随访相结合的形式，记录患者生存状态、肿瘤复发及复发后治疗情况。总生存期定义为从手术日期到任何原因死亡或最后一次随访时存活的时间，肿瘤复发时间定义为从手术日期到肿瘤复发或最后一次随访无复发的时间。随访截止时间为2022年1月。
采用R 4.0.5软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料以表示，不符合正态分布的定量资料以M（IQR）表示，以箱式图展示数据分布特征。定量资料组间比较采用t检验或秩和检验（不符合正态性、方差不齐时）。分类资料采用例数表示，组间比较采用Fisher确切概率法。采用寿命表法估计总体生存率和肿瘤复发率，采用Kaplan-Meier法绘制总体生存率和肿瘤复发率曲线。采用Log-rank检验比较不同组别生存的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。
两组患者的年龄、性别比例、病毒感染情况、慢性病史、术前血小板计数、ALT、AST、Child-Pugh分级、腹水、肝硬化、肝脏萎缩、肿瘤数目、肿瘤大小、肿瘤分期、肿瘤病理学分级、脉管癌栓、肿瘤切缘等情况的差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表1）。新辅助组中的无症状患者比例较常规组少（P=0.049），术前白蛋白水平（P=0.021）、总胆红素水平（P=0.002）、甲胎蛋白水平（P=0.048）均低于常规组（图1）。
新辅助组和常规手术组患者手术信息及术后情况比较
新辅助组和常规手术组患者手术信息及术后情况比较
| 组别 | 例数 | 手术类型（例） | 手术方式（例） | 手术时间（min） | 术中出血量（ml） | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 腹腔镜手术 | 开腹手术 | 大部肝切除（≥3段） | 小部肝切除（≤2段） | ||||
| 新辅助组 | 14 | 2 | 12 | 9 | 5 | 247.6±79.5 | 650（1 200） |
| 常规手术组 | 115 | 12 | 103 | 64 | 51 | 225.9±89.0 | 500（800） |
| 统计值 | - | - | - | t=0.871 | Z=0.591 | ||
| P值 | - | 0.649 a | 0.583 a | 0.386 | 0.554 | ||
| 组别 | 术中输血（例） | 术后输血（例） | 术后并发症（例） | 术后住院时间（d） | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 无 | 有 | 无 | 有 | 无 | Ⅰ~Ⅱ级 | Ⅲ~Ⅳ级 | ||
| 新辅助组 | 6 | 8 | 11 | 3 | 4 | 7 | 3 | 15（8） |
| 常规手术组 | 59 | 56 | 79 | 36 | 33 | 64 | 18 | 13（7） |
| 统计值 | - | - | - | Z=0.121 | ||||
| P值 | 0.584 a | 0.550 a | 0.800 a | 0.903 | ||||
注：表内符合正态分布的定量资料以表示，不符合正态分布的定量资料以M（IQR）表示；a示Fisher确切概率法检验得到的P值；-示无数据
新辅助组患者在新辅助期间疗效的影像评估情况：按RECIST 1.1标准，客观缓解率（objective response rate，ORR）为3/14［均为部分缓解（partial response，PR）］，按mRECIST标准，ORR为5/14（均为PR）；术后病理学评估：病理完全缓解（pathologic complete response，pCR）为1/14，主要病理缓解为3/14。两组患者的术中情况，包括手术类型（腹腔镜手术和开腹手术）、手术方式、手术时间、术中出血量、术中输血等的差异均无统计学意义（P值均>0.05）。两组术后输血比例、术后住院时间和并发症发生率的差异均无统计学意义（P值均>0.05）（图2）。
新辅助组术后Ⅰ~Ⅱ级并发症包括A级肝功能衰竭6例，急性冠状动脉综合征1例；术后Ⅲ~Ⅳ级并发症包括胆瘘3例，经穿刺引流治疗后均痊愈。常规组术后Ⅰ~Ⅱ级并发症包括A级肝功能衰竭53例，胸腔积液或腹水7例，胃肠功能不全1例，心血管疾病2例，切口愈合不良1例；Ⅲ~Ⅳ级并发症包括胸腔积液或腹水行穿刺引流术9例，胆瘘2例，切口裂开伴切口感染3例，重症肺部感染2例，心房颤动1例，C级肝功能衰竭1例。两组术后并发症发生率的差异无统计学意义（P值>0.05）。
新辅助组1年复发率为42.9%，无法估计中位复发时间；常规手术组1年复发率为64.0%，中位复发时间为6.0个月（95%CI：4.2~10.0）；两组复发率的差异有统计学意义（χ²=3.840，P=0.050）（图3）。按肿瘤数目进行分层分析，新辅助组中单发肿瘤患者的1年复发率为25.0%，常规手术组为71.0%，两组差异有统计学意义（χ²=5.280，P=0.022）（图4）；辅助组中多发肿瘤患者的1年复发率为66.7%，常规手术组为58.9%，两组差异无统计学意义（χ²=0.110，P=0.736）。
新辅助组患者的1年总体生存率为100%；常规组患者1年总体生存率为74.2%，中位生存时间为24.6个月（95%CI：21.6~NA），两组患者总体生存的差异有统计学意义（χ²=5.170，P=0.023）（图3）。
高复发率严重影响了肝癌患者手术切除术后的长期生存，新辅助治疗已成为肝癌治疗新的探索方向。近年来，以PD-1/PD-L1单抗为代表的免疫检查点抑制剂逐步成为肝癌最有效的系统治疗方案，但免疫治疗在肝癌新辅助治疗方面的研究较少。近期本中心和两个美国研究团队分别发表了关于肝细胞癌免疫新辅助单臂二期临床研究［4, 5, 6］，研究结果均提示了肝细胞癌免疫新辅助治疗的有效性和安全性。但与常规直接手术相比较，免疫新辅助治疗的术后复发率和手术安全性是否有优势，目前鲜有报道。本研究结果显示，新辅助组患者的1年复发率低于常规手术组，尤其是单发病灶患者的复发率降低得更明显。在安全性方面，新辅助组的术中出血量、手术时间、术后住院时间和术后并发症等与常规手术组的差异均无统计学意义，提示靶免新辅助治疗的安全性是可控和可接受的。20世纪80年代初即有学者尝试将TACE作为可切除性肝细胞癌的术前新辅助治疗方法，14例肝癌患者术前接受了明胶海绵动脉内栓塞和动脉内化疗的联合预处理，手术后病理学检查结果提示肿瘤发生了坏死和液化，研究者推测经导管动脉化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）可能降低了肝细胞癌的复发率和转移率［9］。随后Hwang等［10］为8例可切除肝细胞癌行经导管动脉栓塞术（transcatheter arterial embolization，TAE）治疗，发现TAE可使肿瘤缩小，但未减少术中出血量和缩短手术时间，亦未在延长长期生存方面显示出优势。Shi等［11］回顾性分析了11 079例手术切除肝细胞癌病例的资料，匹配性研究648对（术前行TACE比直接手术）可切除性肝细胞癌患者，发现术前辅助性TACE并不能降低复发率或延长生存期。亦有研究结果提示，术前放疗可提高可切除性肝细胞癌的手术效果［12］。但肝脏作为一个辐射敏感器官，暴露在辐射下易导致严重肝损伤，Loi等［13］回顾性分析了128例使用体部立体定向放射治疗肝细胞癌的病例资料，发现急性期和晚期肝脏毒性发生率分别为 26%（n=37）和 8%（n=11），同时巴塞罗那分期B、C期患者更易出现急性肝脏毒性。可见，TACE、TAE和放疗等传统肝癌治疗方法作为可切除性肝细胞癌的新辅助方案，其疗效有限，也有安全隐患，需探索疗效更佳的方案。免疫检查点抑制剂作为新辅助治疗的方案具有独特的优势，免疫治疗的一个重要条件是具有肿瘤新生抗原，手术前肿瘤体积大、新生抗原多，此时使用免疫检查点抑制剂，可利用众多的肿瘤新生抗原充分激活 T细胞，这些术前致敏的T细胞在术后可有效地根除残留于肝脏局部和远处转移的微小病灶，较术后辅助使用效果更好，这一理论假说已在动物实验中得到证实［14］。另外在一项肺癌免疫新辅助临床试验中也证实了上述理论假说，纳武利尤单抗治疗后外周血中出现多个T细胞克隆扩增，而在切除的肿瘤标本中，亦观察到了这些T细胞克隆，但在使用纳武利尤单抗前，外周血中这些克隆均未检出［15］。本研究结果显示，免疫治疗后病灶内浸润的树突状细胞明显增多，提示新辅助免疫治疗既可促进T细胞增殖，亦可通过扩增抗原递呈细胞，增强杀伤肿瘤细胞的能力［4］，且这种免疫增强效果可在术后继续发挥作用。本研究结果亦证实，术前靶免新辅助治疗可降低术后复发率。同时我们发现，单发病灶经新辅助治疗后，术后复发率较对照组下降更明显，而多发病灶经新辅助治疗后的复发率与对照组无明显差异。多发病灶的术后病理学检查结果显示，其中1例患者的多个病灶均完全坏死，至今未复发，而其余多发病灶患者有1至数个病灶完全坏死，但仍有病灶坏死不明显［4］，提示同一例患者的多个病灶对靶免治疗的反应是不同的，再次证实了肝细胞癌多个病灶具有明显的异质性，且对免疫治疗的敏感性也有差异，这与Huang等［16］的研究结论一致。因此我们认为，对治疗反应最差的病灶决定了术后是否复发，多发病灶的这种“短板效应”值得重视。这也提示对于多发病灶，单纯靶免新辅助方案可能不足以降低术后复发率，尚需要联合其他方案，如局部的TACE治疗。
本研究结果显示，反映接受新辅助治疗患者围手术期手术安全性的多项指标（术中出血量、术中输血量、手术时间和术后并发症等）与常规手术组均无明显差异。新辅助组无因术后并发症再次手术者，亦无围手术期死亡病例，提示靶免新辅助治疗的手术安全性良好。但新辅助组术后发生胆瘘3例（3/14），该3例患者均行穿刺引流后治愈，未行再次手术。较高的胆瘘发生率显然与术前靶免治疗相关，靶免治疗引起的肝脏组织炎性改变，增加了肝脏组织的脆性和肝脏断面小胆管的处理难度，同时还可能与PD-1单抗对于胆管的特异性损伤有关。Simoes等［17］对20例术前使用纳武利尤单抗患者的肝脏切除标本进行病理学检查，发现癌旁肝组织中出现了非坏死性肉芽肿和显著的胆管上皮内淋巴细胞浸润，考虑与术前使用免疫检查点抑制剂导致的胆管损伤有关。由于靶免治疗对于胆管潜在的损伤，增加了肝脏断面胆管术后的胆瘘发生率，因此，需要在术中更为仔细地处理肝脏断面的胆管，尽量采用结扎和缝扎，少用电凝等热处理。
以PD-1/PD-L1单抗为代表的免疫检查点抑制剂和抗血管生成靶向药物联合治疗已显著延长了中晚期肝细胞癌患者的生存时间。本研究结果提示，靶免联合治疗作为可切除肝细胞癌的新辅助方案可降低肿瘤的术后1年复发率，提高患者的1年生存率，且不影响手术的安全性，但更为确切的结果尚需开展大规模肝细胞癌免疫新辅助临床试验，以确定肝细胞癌患者的临床获益。
所有作者声明不存在利益冲突
