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单基因遗传病是同源染色体中单个基因突变（显性遗传病）或者一对等位基因均发生突变（隐性遗传病）引起的遗传病,不受环境因素影响，又称孟德尔遗传病。单基因遗传病大多属于罕见病，但其种类多,达到10 000种以上。若把这上万种单基因遗传病的发生率累计起来，单基因遗传病的总体发生率可达2%~3%[1]，由于单基因遗传病往往致死、致残，且难于治疗，对患者的生活质量将产生极大的影响，产前诊断预防单基因遗传病儿的出生尤为重要。
传统的单基因遗传病产前诊断方法多为有创性操作，即称为侵入性产前诊断，通过手术方式获取胎儿细胞用于产前基因诊断。目前较常用的取材手术有绒毛穿刺取样术、羊膜腔穿刺术、脐静脉穿刺术及胎儿镜活检等。侵入性产前诊断虽然准确度高，但存在约1%的流产风险[2]。与侵入性产前诊断比较，无创产前基因检测（non-invasie prenatal testing, NIPT）无流产、感染等风险，操作简单，需要进一步检测的孕妇群体更容易接受。因此，对单基因遗传病高危群体进行NIPT检测有极大的临床意义。
NIPT技术的发展及其在临床上的应用已近20年。但由于单病种单基因遗传病较少，某些患者存在特异突变，以及检测技术分析较为复杂等原因，NIPT在单基因遗传病的应用方面发展相对较慢。最初的检测仅局限于父源性常染色体显性遗传病，主要包括Huntington舞蹈病、软骨发育不全、Aperts综合征等。而对于母源性基因突变及常染色体隐性单基因遗传病的NIPT还处于探索阶段。随着新技术的不断出现，单基因遗传病的NIPT的研究有了较大进展。目前，在NIPT检测单基因遗传病研究中使用的胎儿DNA，主要有3种来源——母体血液中的胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）、母体血液中的循环胎儿细胞及来源于子宫颈的滋养细胞。
1997年，Lo等[3]在妊娠男性胎儿孕妇的外周血中检测到Y染色体性别决定基因，证实孕妇外周血中存在cffDNA。cffDNA主要来源于胎盘合体滋养细胞，以小片段DNA形式存在，通常长度<313 bp，其中80%<193 bp；cffDNA的浓度随孕周的增加而增大，孕4~5周可在孕妇外周血中检出，cffDNA在孕早期占孕妇游离DNA总量的9%，随着孕周的增加，最高可达20%。cffDNA在孕妇血浆中的半衰期很短，约16 min。cffDNA在胎儿娩出后2 h内，在母体内快速降解，48 h后即检测不到，故对cffDNA的检测不受既往妊娠的影响。基于cffDNA的NIPT已用于多种疾病的检测和研究，包括胎儿性别的鉴定、Rh血型的检测、染色体非整倍体、染色体拷贝数变异的检测等。NIPT用于单基因遗传病的研究也是热点[4]，目前采用的方法主要包括高通量测序、相对单倍体型剂量分析（relative haplotype dosage, RHDO）、数字PCR、低变性温度下复合PCR（COLD-PCR）、实时PCR、微测序等。
高通量测序技术[即新一代测序（next-generation sequencing, NGS）技术]的广泛使用既极大促进了临床医师对特定基因组变异导致的表型变化及疾病的发生有了进一步的了解，同时也为单基因遗传病的NIPT提供了的平台。
传统的相对突变剂量分析（relative mutation dosage，RMD）[5]是基于相对染色体剂量和数字化RNA-SNP方法，通过统计学的序贯概率比试验，判断母体血浆DNA中的突变等位基因及野生型等位基因是否平衡存在，从而判断胎儿是否患病或携带致病基因[3]。而RHDO为目前较受关注的分析cffDNA的方法，即通过先证者及其父母的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）深度测序，推断出孕妇血浆中胎儿的单倍体型[6]。RHDO的基本原理是，利用SNP位点构建先证者父母的单倍体型，并确定父母的风险单倍体型，再通过对cffDNA测序数据的分析构建胎儿单倍体型，分析胎儿是否携带致病风险基因。相较于RMD，RHDO不再依赖于特异突变的检测，敏感度较高。
Xu等[7]基于RHDO方法对杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）妊娠高风险的8例孕妇进行NIPT检测，使用来自父母和先证者的目标区域测序数据构建亲本单倍体型；通过对孕妇血浆DNA测序，使用Hidden Markov模型分析母体血浆cffDNA中的SNP，成功预测出了高风险胎儿，并且通过常规产前诊断方法验证。Yoo等[8]以4个DMD家庭为样本进行了类似的研究，成功检测出1例正常胎儿和3例患病胎儿。类似的研究表明，RHDO也适用于诊断常染色体隐性遗传病。Chen等[9]对有先证者的脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy, SMA）家庭的5例孕妇进行NIPT检测，通过构建父母和胎儿的单倍体型分析确定了2例正常胎儿、2例携带者和1例SMA胎儿，且都通过侵入性产前诊断验证。
RHDO方法最近也被应用在先天性肾上腺皮质增生症的NIPT检测中[10,11]。较传统的RMD方法，在NIPT中采用RHDO方法，能够克服先天性肾上腺皮质增生症中假基因的干扰，正确识别和确定亲代突变单倍体型是否遗传，目前报道可全部正确预测出胎儿基因型[10,11]。
另外，采用高通量测序技术联合RHDO的NIPT方法，可以同时检测DMD、贝氏肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）及SMA共3种单基因遗传病中的任一种，使得DMD、BMD及SMA的NIPT检测可用作无家族史家庭遗传病的筛查手段[12,13]。
基于靶向序列捕获的NGS可用于骨骼发育异常的NIPT，基于该方法的NIPT有助于明确超声检查发现的骨骼发育不良，区分其为致死性或非致死性，为是否终止妊娠提供依据。对于有该疾病家族史、父源遗传或有新发基因突变的孕妇，均可在妊娠早期行NIPT检测。Chitty等[14]针对与软骨发育不全和致死性侏儒相关的FGFR3基因29个已知的致病突变，比较NGS与用PCR限制性内切酶消化法两种方法的检出成功率，证明了基于靶向序列捕获的NGS的NIPT可用来检测存在多个潜在致病突变的基因，且较PCR限制性内切酶消化法更加准确、敏感，可进一步应用于临床[15]。Dan等[16]使用基于靶向序列捕获的NGS检测胎儿骨骼发育不良基因的新发致病突变，应用针对性捕获测序方法分析母亲、父亲基因组DNA及母亲血浆游离DNA，使用生物信息学方法分析测序数据，成功鉴定出16例致死性骨骼发育不良基因的新发突变，并通过羊膜腔穿刺术验证，证实了基于靶向序列捕获的NGS对于新发突变检测的有效性。
在无先证者和胎儿父亲遗传信息的前提下，对单基因遗传病采用NIPT的方法进行多种遗传病的筛查，既可以筛查遗传性的基因突变，又可以筛查新发的基因突变，是无创性单基因遗传病应用的最终目标。2016年，通过对母体血浆cffDNA进行全基因组测序，用改良的第2代无创分析胎儿全基因组方法探索单基因遗传病NIPT的应用潜能，结合一系列生物信息学筛选，提高了胎儿新发突变检测的阳性预测值，达到74%[17]，高于之前已报道研究结果的169倍，该研究显示，胎儿母源单基因遗传病可以通过全基因组测序确定，而无需母亲单倍体的信息，从而极大地提高了分析的分辨率。该研究表明，基于NGS的第二代NIPT突破了原有的需要家族史或先证者遗传信息的限制，且不需要胎儿父亲的基因，能够直接通过孕妇血浆DNA检测胎儿是否患单基因遗传病，有望作为1种筛查手段用于检测普通孕妇群体中的胎儿单基因遗传病。
微滴化数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）技术是一种检测核酸分子的绝对定量技术，其基本原理是将含有核酸分子的荧光PCR反应体系"分散"成数万个纳升级的微滴，核酸分子在各微滴中随机存在，每个微滴含有1个或不含目标核酸分子，每个微滴都是1个独立的PCR反应。经PCR扩增后逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为"1"，无荧光信号的微滴判读为"0"，根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，通过分析软件可直接给出目标核酸分子的拷贝数；与实时PCR技术相比，ddPCR技术具有高敏感度、高准确度、高耐受性和绝对定量的优势，近年来已广泛应用于痕量核酸、稀有突变、拷贝数变异检测等方面。已证明大多数使用ddPCR的单基因遗传病NIPT研究可检测到父源或新发突变，包括囊性纤维化（CFTR基因）[18]、新生儿糖尿病（KCNJ11基因）[19]和软骨发育不全（FGFR3基因）[20]等。Perlado等[21]通过使用SNP模拟单基因遗传病的遗传模式，在55例母体血浆样品中用ddPCR方法进行NIPT的SNP基因分型，通过对父本等位基因检测验证父系遗传，通过RMD检测母本等位基因验证母系遗传，结果提示，ddPCR技术对于父本等位基因的检测准确度可达100%，对母本等位基因的检测准确度可达96%。基于ddPCR技术的NIPT能够检测父系遗传和母系遗传的胎儿单基因遗传病，对于新发突变的检测也具有极大的潜力。
COLD-PCR技术是近年来发展起来的新的PCR检测方法，其基本原理是利用在野生型、突变型混合样品体系中,完全匹配的同源双链较野生型与突变型的杂合双链的解链温度高，从而设定变性温度处于临界变性温度（指比杂合双链解链温度高但比纯合双链解链温度低的临界温度）以达到富集扩增突变片段的目的[22]。COLD-PCR技术克服了传统PCR技术的不足与限制，能够从大量野生型DNA中富集低浓度的突变，具有检测敏感度高，准确性好等优势。且COLD-PCR技术本身为非侵入性的检测，易于与其他检测技术结合使用，在产前诊断方面具有较大的优势。
DNA微阵列（microarray）技术指在固体表面（玻璃片或尼龙膜）上固定成千上万人工合成的寡核苷酸片段，与用荧光或其他标记的mRNA、cDNA或基因组DNA进行杂交，从而同时快速检测多个基因的表达情况或快速检测DNA序列的变异，绘制SNP遗传连锁图，进行DNA序列分析，其基本原理是基于核酸杂交技术，DNA微阵列技术也为NIPT诊断单基因遗传病提供了新思路[23]。
COLD-PCR技术和DNA微阵列技术价格适宜，操作简单、快速，便于在常规产前诊断中开展、应用。Galbiati等[24]研究了上述两种方法应用于β地中海贫血和囊性纤维化的NIPT检测，分别使用COLD-PCR技术和DNA微阵列分析对87和40例孕妇血浆样本进行NIPT，检测胎儿β地中海贫血和囊性纤维化的患病风险，两种方法的检测结果都与侵入性产前诊断结果完全一致。
由于胎盘嵌合体的存在，来源于胎盘的游离核酸与胎儿本身的基因组并非总是一致，导致NIPT检测可能出现假阳性和假阴性结果，因此，针对胎儿游离核酸的检测技术只能作为筛查手段而不能代替诊断，这也促使了NIPT检测的材料从游离核酸向胎儿细胞方向发展。有研究发现，在孕早期的母血中存在微量的胎儿有核红细胞，因其为单核、含有完整胎儿遗传信息且细胞周期短，更适合行全基因组分析，被认为是实施无创产前诊断（non-invasive prenatal diagnosis，NIPD）较理想的靶细胞。孕妇外周血中的胎儿有核红细胞给NIPD检测带来新的希望，但母血中的胎儿细胞非常少，每毫升母血中仅1~6个，虽有成功诊断的报道，但效果欠佳（准确率为74%，假阳性率为0.6%~4.0%）[25]，而且在分离富集过程中存在细胞易损伤、母血污染等问题，限制了其在临床上的应用，因此，母血中胎儿细胞的分离技术是研究的重点问题。目前分离循环胎儿有核红细胞的方法，包括密度梯度离心法、磁场激活的细胞分选法（magnetic activated cell sorting）、荧光激活的细胞分选法（flourescence activated cell sorting）、单个细胞微处理法（micromanipulation of individual cell）以及生物素蛋白柱结合法等。然而，这些技术仍存在细胞纯度和回收率的问题，另外，复杂的操作和昂贵的费用也限制了其用于常规产前诊断。
Byeon等[26]报道了分离胎儿细胞的新技术，提出基于红细胞微流控技术富集和负向富集的两级富集法，用该技术分离得到的胎儿细胞进行遗传学分析并成功确定了胎儿性别。研究表明，该技术分离的细胞率和纯度足以用于NIPD。Kanda等[27]使用改良的基于凝集素的成熟红细胞分离技术和自动化图像分析的组合来分离胎儿成熟红细胞，通过Y染色体上性别决定基因的扩增和荧光原位杂交成功确定了胎儿性别，并对13、18或21三体胎儿进行了成功验证，该技术是1种实用、高效的分离胎儿细胞的方法，临床应用成本与当前的NIPT技术相当。这些新技术的出现，展现了循环胎儿细胞在NIPD应用中的潜能，为单基因遗传病的NIPD提供了新的思路。未来，应用循环胎儿细胞进行单基因遗传病的NIPD或将成为新的热点。
1971年，有研究首先发现了子宫颈黏液中存在脱落的胎儿绒毛细胞，并成功地预测了胎儿性别，证实胎儿来源的滋养细胞可脱落到子宫颈管中，开辟了产前诊断的新途径[28]。与cffDNA比较，来自子宫颈胎儿滋养的细胞的数量不受胎龄（5~20周、母亲体质指数）、胎次或母亲年龄的影响。自该研究发现子宫颈滋养细胞，研究者不断探索子宫颈滋养细胞在NIPD中的应用，包括对单基因遗传病诊断的应用。先后有研究使用从子宫颈脱落细胞中分离的胎儿细胞诊断地中海贫血[29]，而目前需解决的问题是标本母体细胞污染造成的较高的假阳性率。
2014年Bolnick等[30]采用人类白细胞抗原G耦合磁性纳米粒子技术从子宫颈的母体细胞中分离出胎儿细胞，在妊娠早期（妊娠5周起）准确确定了胎儿性别。学者采用这项技术在有先天性肾上腺皮质增生症妊娠风险孕妇的子宫颈细胞中先确定了胎儿性别[31,32]，随后使用NGS确定胎儿基因型，并通过评估激素水平预测了围产期胎儿的表现[33]。Pfeifer等[34]用单细胞激光辅助显微切割法收集胎儿细胞，用短串联重复序列基因分型鉴定胎儿或母体细胞，成功获取了胎儿细胞用于囊性纤维化、SMA的NIPT。
近年来，单基因遗传病NIPT检测技术有了快速的发展，并逐步应用到临床实践中，用于检测各种不同的单基因遗传病。但更有力的分析技术（如单细胞测序[35]等）、更高效稳定的分离胎儿细胞的方法还有待进一步研究，以进一步降低测序成本并增加临床应用的可行性。虽然目前单基因遗传病的NIPT技术上仍有不成熟之处，但相信随着技术的进步和发展，终会在家族性遗传病产前诊断及孕期群体筛查中发挥重要作用。
