《中华结核和呼吸杂志》于1953年7月创刊以来，记录了我国与结核病做斗争的足迹，成为我国结核病学术研究和交流经验的核心期刊，为结核病学科的发展做出了贡献。回顾60年来《中华结核和呼吸杂志》发表的结核病学基础研究成果，既是对前辈的追忆和对既往研究成果的肯定，也可以明确我们的责任和今后努力的方向。

杂志创刊时正值新中国建国之初，资金、技术极度匮乏，结核病学界的前辈克服重重困难，开创了我国结核病学基础和临床研究。1950年国家卫生部在全国各城市推广免费接种卡介苗，同时将异烟肼国产化并用于临床，使结核病发病率明显下降。在结核病基础研究的初始阶段，前辈们根据当时的条件相继建立了MTB染色法、前处理法和培养法，其中一些检测方法一直沿用至今^[1]。这段时期，研究者进行了异烟肼、链霉素和氨硫脲的临床验证，建立了临床细菌学、实验结核病动物模型和实验性结核性空洞技术^{[2,3,4,5,6,7]}。

MTB培养是结核病研究和细菌检出的基础，耐药性确定是治疗耐药结核病的基石。20世纪50年代以来，研究者在极其简陋的条件下对MTB培养和耐药性测定进行了积极探索，先后建立了豌豆琼脂培养基、苏通液体培养基玻片法、引进和改良了Pryce玻片培养法，利用改良罗氏鸡卵培养基检测敏感性，并发现各种液体培养基和固体培养基的培养结果相符。当时创立以谷氨酸钠替代天门冬酰胺的改良罗氏培养基，成为我国临床分离培养的主导培养基，其地位始终未被取代。当时的研究结果：如在异烟肼递增液体培养基中传代获得的实验室耐药株和临床分离耐药株对豚鼠丧失毒力、MTB对异烟肼耐药率增高和致病力降低相平行等，为以后MTB致病力和毒力研究奠定了基础^[8,9]。

20世纪50年代我国开始应用PPD作为诊断MTB感染的指标，但由于我国实行卡介苗接种，且分枝杆菌感染比例较高，因此PPD试验结果对于MTB感染的诊断意义值得商榷^[10,11]。到20世纪60年代中期，北京、上海等大城市的结核病患病率、死亡率已经与日本同期相当，因此出现了盲目乐观情绪，认为结核病将被彻底根除，其结果导致之后一段时间结核病基础研究几乎陷入停顿状态。

20世纪80—90年代，由于结核病疫情在很多国家卷土重来，世界卫生组织(WHO)宣布"世界处于结核病的威胁之中"，"全球结核病处于紧急状态"。结核病的治疗和基础研究得到重视，这一阶段分子生物学技术和理论迅猛发展。转印杂交、基因文库、穿梭载体构建、单体蛋白克隆表达、基因克隆和序列分析、核酸扩增和生物芯片等技术相继建立，并应用到MTB菌种鉴定、结核病诊断、耐药基因检测、临床实践和新疫苗的探索中。

以放射性快速诊断技术(Bactac技术、核酸扩增技术)为代表的快速检测方法相继出现，持留菌、耐药基因及其序列分析及酶联免疫吸附试验(ELISA)法引起新一轮的诊断技术研究热潮。这一时期出现对MTB耐药突变和毒力关系的争论，部分研究者认为MTB耐药性导致其毒力丧失。纽约出现的耐多药(MDR)菌株流行和南印度菌株对小鼠和人类的毒力并不减弱的事实，使人们对动物模型病原学差异和毒力的本质有了新的认识。

这一时期新出现了一系列耐药表型测定法，如Bactec 460、液体变色培养基测定法、噬菌体裂解法和荧光素酶测定法。由快速培养检出转变为微量早期检出生长标志物的概念。人们对第1代自动化分枝杆菌培养系统(Bactac TB460系统)寄予期望，该方法采用液体培养基，可灵敏检测MTB微量生长，并可早期报告结果，但具有放射性。噬菌体裂解法根据有无噬菌斑确定待检标本中是否有存活的分枝杆菌，该方法简便、快速，敏感度和特异度高，不需要特殊的仪器设备^[12]。

20世纪90年代以后，国内外对MTB耐药机制的研究取得较大进展，证实编码过氧化氢－过氧化物酶的基因(katG)和RNA聚合酶(rpoB)基因突变分别是异烟肼和利福平耐药的分子基础^[13,14]。染色体介导的耐药性是MTB耐药的主要方式，染色体多个相互独立的基因自发突变逐步累加是耐多药结核病(MDR－TB)的分子基础，但抗结核药物的分子机制和耐药机制尚不完全清楚。耐药基因检测法在PCR技术的基础上发展而来，主要有PCR－单链构象多态性、PCR－限制性片段长度多态性分析和PCR－DNA序列测定和芯片检测等。

在血清学诊断方面，国内外学者采用脂阿拉伯甘露聚糖、脂多糖、MTB重组蛋白或其他纯化蛋白作为抗原，以胶体金标记，建立了简便、快速的免疫学诊断方法，在检测结核病患者的血清和胸腔积液中抗结核抗体方面，与PPD试验作为抗原的ELISA法并无本质的差别。以ELISA为代表的免疫学方法在国内应用较广泛，对MTB特异性抗原免疫印迹技术的敏感度为89.7%，特异度为95.7%，尤其对肺外结核病和菌阴肺结核具有诊断价值^[15]。

在此时期，也有学者对结核病的细胞免疫机制进行了研究，包括巨噬细胞对MTB生长的影响及卡介苗对肺巨噬细胞内酸性磷酸酶和溶酶体通透性影响等。研究结果表明，活动性肺结核患者的T细胞功能受到抑制，DNA、RNA和蛋白合成显著减少。20世纪90年代我国结核病免疫学进入细胞免疫功能的研究阶段，证实肺结核患者总T细胞和辅助T细胞亚群显著低于健康人，但与病程进展和病灶大小无明显关系，细胞毒T细胞无明显变化，而自然杀伤细胞高于健康人。此外，也有关于细胞因子及其受体、Th1/Th2细胞调控及我国人群对结核病敏感性遗传背景的相关研究^[16,17]。

这一时期是结核病基础研究又一繁荣时期，但由于人免疫缺陷病毒(HIV)和MTB双重感染、MDR－TB发病率增加、对卡介苗免疫效能重新认识等问题的出现，新挑战接踵而至。

2000年全国结核病流行病学抽样调查结果显示，我国MTB耐药率为27.8%，其中耐多药率为10.7%。2007—2008年全国结核病耐药性基线调查结果显示，我国肺结核患者中耐多药率为8.3%，据此估算，我国每年新发MDR－TB患者12万例，占全球每年新发MDR－TB患者总数(51万例)的1/4。由于结核病的发病率高，耐药率增加，使结核病尤其是MDR－TB的基础研究和检测手段的发展变得更加迫切，并推动结核病的基础研究进入了一个飞速发展阶段。

1998年，破译H₃₇Rv基因组全序列是结核病研究史上又一个里程碑式的事件^[18]。这一研究成果标志着结核病研究进入结构和功能基因组学的时代，从而使研究者能够将前基因组时代的零散信息整合在一起。通过H₃₇Rv基因组数据和其他微生物基因数据的比较，确定了40%预测蛋白的精确功能，鉴定了44%的同源蛋白，其余16%为独特的未知蛋白。随着基因组学研究的进展，转录组学(包括miRNA)、蛋白质组学和代谢组学研究逐渐兴起，为阐明细菌致病机制和机体的功能调节、筛选新药靶点和诊断标识、研发新疫苗等方面都具有重要意义。

传统的萋－尼抗酸染色涂片镜检方法仍是我国传染性结核病患者的主要检测手段，但其敏感度仅为40%～60%，且方法繁琐，假阳性和假阴性较高。最新的LED显微镜则将低廉的发光二极管与显微镜相结合，其检出率高，价格低廉，寿命长，可用电池供能，可靠性更强，诊断性能优于标准荧光显微镜。

目前普遍应用的罗氏培养药敏试验和分枝杆菌快速培养系统远不能满足临床诊治需求。近年来出现的耐药表型检测和耐药分子检测技术使MTB耐药性检测技术有了较大发展，并具有临床应用前景。Bactec MGIT 960全自动分枝杆菌培养、鉴定和药敏系统的操作简便，阳性标本检出时间短，阳性率高，而原来的Bactec 460TB系统由于其读数时间长和放射性等原因已淡出市场。目前WHO推荐在部分地区(主要为低收入国家)推荐使用Bactec MGIT 960液体培养技术。属于液体培养基药敏试验的微孔板液体培养基药敏试验，不仅可直接对痰液进行直接药敏试验和MIC测定，还可以对多种药物进行耐药性检测，具有快速、准确、简便和经济的特点，与Bactec 960比较，符合率在90%以上，有较高的推广价值^[19,20]。

近年的研究结果表明，持留菌可能由静止期菌、抗结核药物治疗后仍存活的菌和休眠菌组成。我国学者认为，以异柠檬酸支路代谢为代表的厌氧代谢表型特征作为持留菌本质性界定标准是合理和可操作的，并可依据其持留代谢程度，将持留菌分为代谢持留菌和休眠持留菌两类，分别介导病程迁延和宿主潜伏感染。这样的界定有利于基础研究和制定临床对策。持留态MTB对药物处于耐受状态，这是导致结核病病程迁延和复发的重要原因，而结核病病程迁延又增加了耐药MTB产生的机会^[21]。

在耐药基因研究中，目前比较明确的为异烟肼和利福平，检测katG、inhA和rpoB耐药基因突变、基于核酸扩增技术等成为新兴的耐药检测技术，包括线性探针法、分子信标技术、DNA测序、变性高效液相色谱技术和Xpert MTB/RIF检测技术。Xpert MTB/RIF检测技术的原理是利用利福平耐药性相关基因rpoB特异性结合分子信标，检测rpoB基因的利福平耐药基因决定区有无突变。另外，与其他药物相关的耐药基因，包括与乙胺丁醇相关的embB基因、与吡嗪酰胺耐药相关的pncA基因、与链霉素耐药相关的rpsL和rrs基因及与喹诺酮耐药相关的gyrA和gyrB基因。目前耐药基因的检测已取得很大进展，存在的问题有：尚未找到各种药物的全部或绝大部分耐药基因，某些突变基因与耐药的关系不明确，直接测定临床标本的耐药性尚存在问题，与耐药基因突变有关的可能诱发因素尚不清楚^[22]。

结核病发病的免疫学机制在这一时期有了显著的发展。研究结果显示，在初始免疫反应中，Toll样受体(TLR)对微生物的识别和抗原递呈细胞的活化、下游的髓样细胞分化因子88(MyD88)将微生物的识别和抗原递呈细胞(巨噬细胞和树突细胞)活化相联系，参与启动初始免疫反应、T细胞活化和诱导获得性免疫反应，TLR和MyD88也在细胞内菌的自我吞噬中发挥重要作用。Th17细胞是2005年鉴定出的一种新Th细胞亚型。Th1和Th17细胞之间存在交叉调节作用，这对于MTB感染的免疫病原学结果具有重要作用。Th1、Th2和Th17之间不仅存在交叉调节，而且调节性T细胞(Treg细胞)和Th17效应细胞产生一种相互排斥反应，这两种细胞的激活依赖于是否有转化生长因子－β(TGF－β)或TGF－β与IL－6的存在，这两种细胞也能够互相促进发育，两者在炎症反应的发生和控制中发挥相反作用，共同构成一个新的免疫网络。Treg细胞的主要功能为延缓适应性免疫反应，在细胞免疫反应产生的早期抑制抗原递呈细胞的功能，抑制引流淋巴结中T细胞反应的启动，因此导致抑制效应T细胞的增殖和分化，并有细胞溶解作用^[23,24]。

结核病保护性免疫的研究提示，MTB感染机体后诱导机体T细胞转化为效应T细胞，通过分泌各种细胞因子(主要是干扰素)发挥免疫学效应，以清除病原体。而γ－干扰素释放试验(IGRAs)就是基于此原理，即通过抗原刺激体产生细胞免疫反应，并根据细胞免疫情况判断是否存在MTB感染。1998年，MTB基因组数据公布，发现在致病性分枝杆菌中存在差异区(RD区)，而在卡介苗和大多数环境分枝杆菌中则不存在上述区域。2000年以来，大量研究应用RD1区域编码的早期分泌抗原－6(ESAT－6)和培养滤液蛋白(CFP－10)这两种蛋白作为抗原进行γ－干扰素检测，证实这种检测技术在诊断MTB潜伏感染等方面具有较高价值。2010年美国疾病预防控制中心建议，尽管IGRAs的准确性和对发展为活动性结核病的预测作用有限，但是在各类人群中的应用并无很大缺陷。PPD和IGRAs可用于辅助诊断MTB感染，包括具有或将有感染MTB的风险，以及感染MTB将进展为活动性肺结核的个体。然而在我国等结核病高流行国家，这种实验存在局限性，其应用价值还需要大量研究进一步印证^[25]。

由于体液免疫在结核病发生、发展和结局的相关性未得到证实，抗体反应延缓性和MTB抗原存在广泛的交叉反应，国内外研究结果显示血清学检测对结核病诊断和疗效评价价值有一定的局限性。2011年WHO据此发表声明：没有证据证明现有的商品化试剂盒能够改善患者的疾病结局，这种血清学检测诊断结核病带来的风险超过潜在的收益。因此不推荐将血清学检测结果作为可疑肺结核或肺外结核的诊断依据(HIV感染除外)^[26]。但是，国内一些研究结果与WHO的上述声明相悖，与涂片和培养结果比较，血清学检测可提高结核病的检出率，尤其适用于菌阴肺结核及不易取得细菌标本的肺外结核诊断和鉴别诊断，同时实验简便、快速，价格低廉，符合我国现阶段的国情，因此血清学检测目前可以作为菌阴肺结核和肺外结核的辅助诊断方法在临床应用^[27]。

非结核分枝杆菌(NTM)感染也是值得关注的问题。我国1990年结核病流行病学调查中NTM分离率为4.9%，而2000年这一比例高达11.1%。近20年来随着获得性免疫缺陷综合征(简称艾滋病)的流行，播散性NTM感染日趋增多，已成为艾滋病患者全身感染的常见原因之一。因此，建立NTM鉴定与药物敏感性测定等方法和规范是紧迫的任务。目前，NTM感染药敏试验仍采用改良罗氏培养，再经过对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩二羧酸肼(TCH)鉴别培养。高效液相色谱法鉴别缓慢生长NTM，具有快速、实用和可靠的特点，可用于鉴定Bactec 7H12B分枝杆菌菌种及抗酸染色阳性标本中鸟分枝杆菌复合群，其缺点是不能鉴别新的NTM菌种。分子生物学方法包括吖啶酯标记的DNA探针测定法、PCR或多重PCR、PCR－限制性片段长度多态性分析和直接核酸测序也可用于鉴定NTM，但这些方法用于诊断NTM的特异度还需进一步证明^[28]。

结核病基因组学研究的进展使得各种组学研究迅速发展，转录组学(含miRNA)、蛋白质组学及代谢组学的研究结果显示，在结核病和MTB潜伏感染病例中，可能含有差异的基因表达谱、miRNA及蛋白、代谢产物等，将来这些差异表达分子可能作为结核病诊断的分子标识。研究结果表明，活动性肺结核和健康对照人群的血清中有92种miRNA存在差异表达，其中miR－29a用于鉴别活动性肺结核的准确度较高^[29]。应用双向荧光差异凝胶电泳联合液相色谱质谱/质谱联用技术检测活动性肺结核患者的结果表明，视黄醇结合蛋白－4、胎球蛋白A和维生素D结合蛋白为最先鉴定的差异蛋白质，这些蛋白质有可能作为生物标识，并有助于研究发病机制^[30]。

卡介苗是目前许多国家批准用于人体的唯一结核病疫苗，多年来卡介苗在世界范围内广泛接种，但成人结核病感染率和病死率居高不下，可见其对成人肺结核的保护效果并不令人满意。因此，寻找具有持久免疫性的新型抗结核病疫苗已成为当前疫苗研究的紧迫课题，而MTB基因组学研究的进展使疫苗研发进入到新时期。目前国内外各种不同用途的疫苗，包括治疗疫苗、预防潜伏感染疫苗和加强免疫用疫苗等正处于不同的临床试验阶段，具体有重组卡介苗疫苗、Ag85A DNA疫苗、重组耻垢分枝杆菌疫苗和MVA85A。国内用于结核病治疗的母牛分枝杆菌(M. vaccae)疫苗已经获得生产文号，可预防结核病潜伏感染的疫苗研究也取得了一定的进展，一些疫苗已进入临床试验阶段，但上述疫苗的治疗和预防作用还需要大量研究加以验证^[31]。

近年来，随着MDR－TB和广泛耐药结核病的发病率逐渐增高，治疗耐药结核病的相关药物基础研究也逐渐增多，细胞壁肽聚糖合成、分枝杆菌酸合成、ATP合成酶、蛋白质合成及芳香族氨基酸合成等有关途径有可能成为抗结核药物新的靶点。正在研究的药物包括：利福类衍生物、氟喹诺酮类、硝基咪唑吡喃类、噁唑烷酮类、二芳基喹啉类化合物、吡咯类、二胺类和吩噻嗪类，以及脂肪酸和分枝菌酸合成抑制剂等，其中多种药物的体外实验研究已证实具有良好的抑菌活性，一些药物经过临床试验证实有较好的抗结核作用^[32]，但尚需深入研究进一步加以证实。

近年来结核病基础研究各个领域虽有长足的发展，但是整体水平上相对滞后于其他医学学科，仍处于初始阶段。展望未来，我们感到任重道远。适逢国家传染病科技重大专项结核病项目实施，依靠国家政策和资金的大力扶持，借助《中华结核和呼吸杂志》这一平台，经过结核病学相关工作者的拼搏努力，相信在不久的将来，我们将在结核病的发病机制、耐药机制和诊断方法等方面取得突破，为国家的结核病防控奉献自己的绵薄之力。