针对河南省2017年首例基孔肯雅热病例开展流行病学调查和病原特征分析。采用荧光定量RT-PCR方法诊断病例，采用金黄地鼠肾细胞BHK-21分离基孔肯雅热病毒，测定病毒全基因序列、开展进化分析。分离株CHIKV/Henan001/2017属于ECSA基因型，与2016年中国香港输入株hk02在E1基因区段核苷酸同源性最为接近（99.8%）。流行病学调查和分子进化分析同时证实河南省2017年首例基孔肯雅热病例为输入性病例，病例未在河南境内引起继发流行。
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基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）引起，经伊蚊传播，以发热、皮疹和关节疼痛为主要特征的急性传染病。基孔肯雅热的地理分布与媒介伊蚊的地理分布相关，在非洲次撒哈拉地区、东南亚地区、印度洋沿岸及岛屿、西太平洋地区的热带或亚热带区域呈地方性流行。20世纪80年代我国云南地区发现一例基孔肯雅热病例。2008年以来，广州、深圳等地先后报告数起输入性病例。2010年9月东莞发生国内首次基孔肯雅热流行[1,2,3]。2017年12月，河南省发现本省首例基孔肯雅热输入病例，现报道如下。
2017年12月15日，调查对象为1例基孔肯雅热疑似病例，男，40岁，河南洛阳人，有疫区旅行史和相应的临床表现。采集病例急性期血清样本行基孔肯雅热病毒核酸检测，结果呈阳性。
以《基孔肯雅热预防控制技术指南（2012年版）》[4]为依据，采用《基孔肯雅热流行病学调查方案》开展进行流行病学调查。
采用Qiagen QIAamp® Viral RNA Mini Kits（德国Qiagen公司）提取总RNA，上海之江生物科技有限公司生产的基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）进行核酸检测，所有操作均按照试剂盒操作说明进行。
采用BHK-21细胞常规分离培养基孔肯雅病毒，在生物安全三级实验室进行操作。
参照CHIKV hk02株（GenBank序列号：MF499120）利用Primer 5.0软件设计CHIKV全基因测序引物，引物序列见表1，由南京金斯瑞科技有限公司合成。
基孔肯雅病毒全基因测序引物
基孔肯雅病毒全基因测序引物
| 引物 | 序列（5 ′ ~3 ′） | 基因组定位 | 片段长度（bp) | |
|---|---|---|---|---|
| P1 | ||||
| 上游 | CTGCAAAGCAAGAGATTAATAAC | 2~24 | 827 | |
| 下游 | TAAATGGAACACCGATGGCA | 808~827 | ||
| P2 | ||||
| 上游 | GCTAAAACCGTGCGACCGTG | 725~744 | 816 | |
| 下游 | TCTGCTTCTCGTTCTTCCTC | 1 521~1 540 | ||
| P3 | ||||
| 上游 | CAAAAACCGACCTGATCCCA | 1 456~1 475 | 827 | |
| 下游 | TTCTTGGCAGTTTTCTTTCT | 2 263~2 282 | ||
| P4 | ||||
| 上游 | GTCTTCGGAGTACCGGGATC | 2 184~2 203 | 813 | |
| 下游 | ATGCTCCACCTCCCACTCCT | 2 977~2 996 | ||
| P5 | ||||
| 上游 | AAGGTAAACTGGTATGGAAG | 2 887~2 906 | 830 | |
| 下游 | ATGGTGTATGCGAAAAGGTG | 3 697~3 716 | ||
| P6 | ||||
| 上游 | CGGACTACACATACAACCTA | 3 619~3 638 | 860 | |
| 下游 | CTTCTCCCATTCTTTGTCGC | 4 459~4 478 | ||
| P7 | ||||
| 上游 | TCACTGAACCACCTCTTTAC | 4 398~4 417 | 864 | |
| 下游 | AGTCAGGTTTCTCCCTCGCC | 5 242~5 261 | ||
| P8 | ||||
| 上游 | CCGTGTCTGACTGGGTAATG | 5 191~5 210 | 846 | |
| 下游 | GGTATGATGAGACAGTTGGA | 6 017~6 036 | ||
| P9 | ||||
| 上游 | TTGTCCAATCCCGAGTCCGC | 5 961~5 980 | 833 | |
| 下游 | CTAACAGCATCAAAGCAGTA | 6 773~9 792 | ||
| P10 | ||||
| 上游 | TTGGAAACGGACATAGCCTC | 6 720~6 739 | 827 | |
| 下游 | AAAAGTTTGGGTTGGGATGA | 7 527~7 546 | ||
| P11 | ||||
| 上游 | GCAGAAGCCGACAGCAAGTA | 7 479~7 498 | 847 | |
| 下游 | CACATAACTGGGATGGCAAG | 8 306~8 325 | ||
| P12 | ||||
| 上游 | TCTCGGTGGTGACCTGGAAT | 8 238~8 257 | 826 | |
| 下游 | ATCTTTACGTTGCCGGACTG | 9 044~9 063 | ||
| P13 | ||||
| 上游 | AGCACCGCCGCAACTACCGA | 8 969~8 988 | 848 | |
| 下游 | AATAAAGGTTGCTGCTCGTT | 9 797~9 816 | ||
| P14 | ||||
| 上游 | ACCGTCCCTTTCCTGCTTAG | 9 713~9 732 | 863 | |
| 下游 | CTCTCAGGTGTGCGACTTTG | 10 556~10 575 | ||
| P15 | ||||
| 上游 | ATGGACTACCCGCCCTTTGG | 10 505~10 524 | 1 229 | |
| 下游 | TCCCCTGTGGGTTCGGAGAATCGTG | 11 709~11 733 | ||
采用宝日医生物技术（北京）有限公司的Takara Reverse Transcriptase XL（AMV）逆转录酶和随机引物合成cDNA，采用宝日医生物技术（北京）有限公司的Takara Premix Taq® Version 2.0（Loading dye mix）试剂，用上述引物扩增基孔肯雅病毒全基因序列。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共40个循环，最后于72 ℃延伸10 min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
序列拼接采用DNAStar 8.0软件，序列排列采用Clustalx 8.0软件，系统进化分析采用MEGA 5.0软件，依据软件使用说明进行操作。
2017年12月3日，病例至斯里兰卡首都科伦坡旅游，2017年12月13日搭乘飞机经马来西亚吉隆坡中转回国，2017年12月14日凌晨5∶00到达北京，上午9∶00返回居住地洛阳。2017年12月15日凌晨5∶00病例出现腰部疼痛并发热、体温37.8 ℃，上午8∶00腰部及全身疼痛加重，波及胸部及双肩，胸部自查有皮疹，随至洛阳市中心医院住院治疗。病例外出及归国无同行人员。自病例住院，于2017年12月15和16日采集急性期血清样本进行相关检测。
2017年12月15和16日血清样本检测结果均呈孔肯雅病毒核酸阳性，Ct值分别为17.459和20.346。
将急性期血清样本接种至单层BHK-21细胞，于接种后第二代第3天开始出现细胞病变，表现为细胞圆缩、融合、脱落现象，传代后病变表现稳定。分离培养物经荧光RT-PCR方法检测基孔肯雅病毒核酸，结果呈阳性，命名为CHIKV/Henan001/2017。
基孔肯雅病毒全基因序列扩增均获得特异性条带，经测序、拼接得基孔肯雅病毒全基因序列，递交GenBank获得序列号为MG925665。
将CHIKV/Henan001/2017 E1基因序列与自GenBank筛选的基孔肯雅病毒毒株进行序列分析。CHIKV/Henan001/2017属于ECSA基因型；与2016年中国香港输入株hk02同源性最高（核苷酸和氨基酸同源性均为99.8%）；其次与2016年印度株119067同源性较高（核苷酸和氨基酸同源性均为99.5%），与2016年澳大利亚输入株IN16C1同源性较高（核苷酸和氨基酸同源性均为99.5%）。CHIKV/Henan001/2017在E1基因区段与2010年广东东莞疫情株（GD05/2010），2008年马来西亚输入株（FD080178和FD080231），2008年斯里兰卡输入株（FD080008和SD08Pan）核苷酸同源性为98.7%~99.2%，氨基酸同源性同为98.7%~99.2%，见图1。
本研究采用核酸检测、病毒分离和序列测定的方法确诊病例为基孔肯雅热病例。疫情输入时值冬季，蚊虫活动相对静止，因此仅对病例采取了防蚊、隔离治疗措施。病例痊愈、潜伏期结束即解除隔离，没有发现疫情扩散和蔓延。流行病学调查显示病例可能在斯里兰卡期间感染基孔肯雅病毒，为输入性病例。进化分析显示，CHIKV/Henan001/2017株与2016年中国香港hk02株在E1基因区段亲缘关系最为密切，其次与2016年印度119067株、与2016年澳大利亚IN16C1株亲缘关系较近。hk02株同为输入株，输出地不详；119067株为2016年印度流行株，IN16C1株为输入株，输出地为印度，进化分析结果显示CHIKV/Henan001/2017株与印度地缘关系更为密切。但是，考虑到基孔肯雅病毒E1基因序列高度保守、斯里兰卡基孔肯雅病毒毒株序列有限以及基孔肯雅热近年主要在印度洋地区流行等因素[5,6]，研究认为CHIKV/Henan001/2017株与印度的密切关系具有一定的偶然性，病例自斯里兰卡输入的可能性更大。
寨卡、登革热和基孔肯雅热等虫媒病毒病主要通过节肢动物叮咬传播，虫媒病毒在全球分布广泛，可以随着人员流动、宿主和/或媒介迁移而传播至异地，在当地引起暴发或流行。随着中国与国际社会的合作交流日益深入、人员流动更加广泛和频繁，虫媒病毒病异地传播的种类、范围和影响也随之增大。2014年河南省禹州发生一起输入性登革热病例引发本地流行的事件[7]，2016年河南郑州发现并控制一起输入性寨卡病毒病事件。河南地跨热带和亚热带气候，存在多种媒介昆虫，人口众多，交通发达，有利于虫媒病毒的增殖和虫媒病毒病的传播。掌握河南虫媒病毒病流行规律，密切关注国际社会虫媒病毒病发展态势，做好技术和物资储备，是防控虫媒病毒病的有效措施。
所有作者均声明不存在利益冲突
