为促进人乳头瘤病毒(HPV)检测试剂盒临床功能验证设计的规范化，中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)和美国国家食品药品监督管理总局(FDA)分别针对HPV检测试剂盒核酸检测的准确性验证和临床功能，包括不明意义非典型鳞状细胞(ASC－US)人群分流、联合筛查和初筛的有效性验证方面，从临床试验设计或评价等方面推荐了较为详细的指导原则。中美两国指导原则在研究设计、研究对象、样本量估计和统计分析等关键点的要求略有差异，但评价指标类似。按照CFDA指导原则要求，可采用横断面研究设计代替FDA建议的前瞻性设计进行ASC－US人群分流用途的验证；同时采用前瞻性研究设计，对同一个自然人群进行拟申报产品HPV和细胞学平行检测，通过至少3年细胞学随访，对初筛和联合筛查进行拟申报产品的临床有效性验证。
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大量的科学研究表明，宫颈癌通过定期筛查可以预防和控制。高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染则是导致宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及宫颈癌的主要原因，所以基于高危型HPV检测筛查宫颈癌的灵敏度可轻易达80%以上，使其成为较为理想的筛查工具，也使基于HPV检测的宫颈癌筛查呈现出全球化的趋势[1,2]。
中国国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration, CFDA)也相继批准了60种以上的HPV检测试剂盒，但在以往的评价过程中，主要强调了HPV检测的核酸准确性，以单独的HPV感染为评价终点上市的产品，没有以筛查疾病作为评价终点。因此，这些产品应用于早期宫颈癌筛查时的临床效果和临床意义均不明确。2011年美国食品药品监督管理总局(Food and Drug Administration, FDA)公布了高危型HPV检测及基因分型试剂技术审查指导原则[3]，根据此指导原则，2012年在美国开展了Cobas HPV检测试剂盒的临床注册性研究，验证了该产品在无明确意义的非典型细胞(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC－US)人群分流和联合筛查中均有较好的临床性能，同时进一步提供了HPV检测可用于初筛的证据。2014年12月，FDA又公布了尚未正式实施的更新版指导原则，增加了对HPV检测可应用于初筛的内容要求[4]。CFDA在2015年也制订了相应的指导原则，原则指出，在已上市的HPV产品注册到期更新或申报时，在以后相应的临床试验中，需提供HPV检测试剂盒的预期临床用途的支撑数据，验证拟申报的HPV检测产品是否可用于ASC－US人群分流、联合筛查和初筛[5]。在本文中，我们对中美两个指导原则[4,5]中主要评价内容(核酸准确性验证和临床各功能有效性验证)的重点和疑点进行解读。
评价HPV检测试剂盒必须考虑两个关键点：(1)该产品是否可以检测出相应的某些或某个HPV型别感染，即核酸检测的准确性验证；(2)当其应用于临床筛查时，该HPV检测是否较准确地检出早期宫颈癌，即临床功能的准确性验证。核酸准确性是基于HPV检测的分析性能，临床功能准确性则基于HPV检测的临床性能，故在介绍两个关键点评价之前，我们先介绍HPV检测的分析性能和临床性能。
任何一种检测系统评价均有两种性能指标，即灵敏度和特异度(分析性能)、临床(诊断)灵敏度和特异度(临床性能)。对于HPV检测来说，其分析灵敏度是可以检测到的最低的HPV病毒载量，其临床意义是将真正的HPV感染者检测为HPV阳性的可能性，而临床灵敏度则需要根据和临床疾病结局相关病毒载量的诊断截断点来判断，其临床意义是将病理诊断结果为癌前病变或癌[中度或重度CIN及以上(CIN2＋或CIN3＋)]的受试者正确诊断为患者的可能性；特异度则是排除HPV感染、CIN2＋或CIN3＋的能力。分析性能和临床性能的应用截然不同。
在宫颈癌筛查中，临床医师需要利用与临床结局相关的HPV病毒载量值来决定是否需要随访和治疗，而忽略与临床无关的HPV感染，所以需要评价临床灵敏度和特异度(临床性能)等指标。如果仅考虑和临床无关的分析灵敏度(如<10拷贝的PCR HPV DNA检出限)可以检出或筛出更多HPV感染者，但是大多数HPV感染并不会检出宫颈癌前病变，会导致没必要的随访、诊断和治疗。因此，必须确定HPV检测的临床诊断截断点，如第二代杂交捕获试验(hybrid capture 2, HC2)检测试剂盒的5 000拷贝为临床截断点。而分析灵敏度在观察病毒的持续性感染及疫苗的研发中有着重要作用[6]。但各种产品分析灵敏度和临床灵敏度不具可比性。
在临床试验评价中，整体研究设计和评价指标等将是决定临床试验是否能成功的关键步骤。针对中美两个指导原则中核酸准确性验证和各临床功能验证内容，从研究设计、评价内容和样本量估计等方面进行解读[4,5]。
中美两个指导原则中均要求拟申请的产品应选择已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品和(或)核酸序列测定方法作为对比方法。
中美两个指导原则中对研究设计内容做出了不同的界定。根据FDA指导原则，要求拟申请产品在预期用途验证(ASC－US分流、联合筛查细胞学正常人群及初筛)人群中完成HPV核酸检测准确性验证。而根据CFDA指导原则，HPV核酸检测的准确性验证和临床预期用途验证可分开来验证。由于获批产品已经完成了核酸准确性验证，所以，拟申请产品到期更新时可能仅需要补充验证临床预期用途的试验。两个指导原则在研究对象要求方面也做出了不同界定。FDA要求HPV核酸检测准确性验证需要在筛查的人群中评估；CFDA则仅对样本的疾病结局做了粗略要求，即可在横断面研究中或有既往标本(需要在试剂要求的检测期限内)的人群进行验证，但也需较好的研究设计作支撑。
在中美两个指导原则中，分别对3个具体预期用途的临床有效性验证进行了介绍，包括ASC－US人群分流、初筛和联合筛查。我们也将从研究设计、评价内容和样本量估计等方面的区别和疑点进行解读。
中美两个指导原则在入组的ASC－US人群研究设计方面要求不同。FDA要求ASC－US分流验证时，需开展至少3年前瞻性的随访研究，其入组的受试者可来自未知细胞学结果的大样本筛查人群(即普通人群中诊断为ASC－US患者)，也可是直接入组细胞学诊断为ASC－US的人群(即来自于门诊或住院患者)。
按照CFDA指南则可在横断面研究中完成验证，且较为可行。入组人群来源也可来自普通筛查人群、门诊或住院患者。如果在一般的筛查人群中进行，需要较大的样本量，而直接入组的门诊或住院患者中的ASC－US人群，会大大减少需要筛查人群的数量，但临床工作的特点会导致入组的窗口期长。在我国现有的医疗形式下，门诊和住院患者的随访程序仍未完善，失访比例较大。因此，依靠细胞学的重复测量达到较高灵敏度较难实现。而该功能的验证主要强调的是对细胞学诊断ASC－US人群的分流，指导阴道镜转诊，且根据来自妇科肿瘤循证医学协作组及一项Meta分析，在检测CIN2＋或CIN3＋时，应用HPV检测对ASC－US患者进行分流策略的横向精度优于传统的重复细胞学检查[7]。这就提示我们，可以进行横断面研究来验证拟申报产品该功能的ASC－US分流用途。
样本量估计时，需综合考虑预期产品性能及试验设计。FDA推荐采用Score方法，考虑预期临床性能及双侧95%可信区间的下限估计样本量，但对95%可信区间的下限值未明确界定；CFDA提出按照检测试剂灵敏度和疾病发病率等估计样本量，且临床终点CIN2＋例数不少于60例。如果按照横断面设计，计算样本量时仅需考虑疾病现患率，而在此设计下的样本量会较大[8]。故欧洲FDA在进行HPV初筛预期用途评价中，应用了病例浓缩化的研究设计，该指导原则要求，拟申报的HPV DNA检测法应以HC2或GP5＋/6＋ PCR为对照的非劣效试验，其灵敏度和特异度的95%可信区间下限分别≥0.90和0.98，且为保证样本代表性，应从筛查人群中选择研究对象，并要求至少具有60例CIN2＋和800例CIN1，这就大大降低了样本量[9]。
对宫颈细胞学检查结果未知的女性，需进行HPV检测和细胞学检查，开展至少3年前瞻性随访研究。但两者阴道镜转诊及随访要求有所不同。
(1)阴道镜转诊原则：CFDA要求仅HPV16和(或)18阳性、HPV阳性同时≥ASC－US的受试者需转诊阴道镜；FDA则要求所有HPV阳性、细胞学异常及随机抽取部分HPV阴性的人群、细胞学结果不满意的人群均需转诊阴道镜，在基线筛查中以尽可能地检出CIN2＋。
(2)随访原则：CFDA要求基础检查结果HPV阳性或细胞学检查≥ASC－US的受试者(基线和随访中CIN2＋者退出研究)每年接受随访，HPV阴性且细胞学检查为正常的受试者第3年时随访或在研究结束时随访。FDA要求在基线转诊阴道镜人群中，病理结果为CIN2＋的达到研究终点退出研究，<CIN2人群每年随访，另外，随机选择部分基线HPV和细胞学结果均为阴性的受试者，进行第3年随访。但随访方法均采用细胞学检查，随访中细胞学≥ASC－US需转诊阴道镜。
在HPV初筛验证中，我们需对以下2个疑点加以明确。
(1)HPV初筛、HPV检测和细胞学联合筛查均需细胞学检查：HPV作为初筛策略一直存有争议，主要在于虽HPV检测灵敏度较高，但同时导致了假阳性率增加、阴道镜转诊增加等，故需要通过随访来评估其真阳性率和真阴性率。当评估Cobas HPV检测是否可作为初筛方法时，也需要回答两个关键问题：①HPV检测和细胞学检查哪个更为安全，可通过比较两组间3年和5年的CIN3＋累积发病率，确定HPV检测的安全性；②与现有细胞学为主导筛查策略相比，HPV初筛策略的有效性如何，可通过比较不同筛查策略的各临床性能，确定其有效性[10]。故当评估初筛时，仍需要比较细胞学检查的结果。
(2)细胞学筛查及随访时间：在横断面筛查中，由于不可能每个受试者均进行阴道镜下活检，拟申报产品可能存在假阴性的问题，需要通过随访来评估，而随访的时间依赖于疾病的病程长短，宫颈癌前病变的进展相对较缓，且基于细胞学筛查的随访周期一般为3年。而采用细胞学随访原因较多，可能的原因：①较好的性能：基于荷兰的大型人群研究结果，细胞学检查具有较好的特异性，基于人群HPV检测阳性人群的分流中，采用细胞学检查进行分流(≥ASC－US)，然后于12个月时进行重复细胞学检查，其整体阴道镜转诊率为1.7%，其阴性预测值为99.3%[11]。②细胞学仍是目前医师普遍认可的筛查方法，医师可以直观评估细胞学的改变，便于向患者解释。
基线30岁及以上的细胞学检查正常的人群(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)中，进行至少3年的前瞻性研究。但中美两个指导原则中的随访方式有所不同，在FDA的指导原则中，仅需按照以下任一种方式完成随访：(1)基线所有无分型产品检测阳性人群将进入随访阶段，虽随访中进行了细胞学检查和HPV检测，为避免偏倚，仅细胞学为≥ASC－US的人群(不论HPV检测的状态)需要转诊阴道镜，必要时活检。(2)基线所有HPV检测阳性(拟申报产品或对比产品)和随机抽取部分HPV阴性人群转诊阴道镜，必要时活检，也采用细胞学随访。
CFDA原则中，基线HPV检测为阳性人群将进入每年的随访阶段，而HPV阴性则于第3年进行随访，随访中仅采用细胞学检查，转诊阴道镜不依赖于HPV检测。在该功能的验证中，我们需对以下3个疑点解读。
(1)仅纳入NILM人群以评估联合筛查：根据2007年美国阴道镜和宫颈病理学会(American Society of Colposcopy & Cervical Pathology, ASCCP)发布的宫颈癌筛查结果异常女性的管理指导原则 [12]及更新版原则[13]，细胞诊断结果为低度鳞状上皮内病变(low grade Squamous intraepithelial lesion, LSIL)及以上，且HPV检测为阳性时，需直接转诊阴道镜，HPV检测阴性者建议12个月后重复检查；细胞学结果为ASC－US的人群推荐采用HPV检测来分流；而在30岁及以上的NILM人群中，推荐进行HPV检测与细胞学检查联合筛查，检测结果为NILM及HPV阳性的人群，在基线建议不转诊阴道镜，需在1年后进行联合检查，细胞学≥ASC－US或HPV持续感染的人群将直接转诊阴道镜；对于基线细胞学检查和HPV检测均为阴性的人群，应进行3年后联合检查。对于可分型的检测，由于考虑到该高危型HPV阳性对宫颈癌的高危险性，这些感染人群在基线筛查时需立即转诊阴道镜。
(2)HPV检测试剂上市情况：FDA要求，如果拟申报产品可提供基线ASC－US分流和30岁及以上人群联合筛查应用中，与FDA已经批准认可的产品可达到较高一致性，且安全和有效情况下，可批准其快速上市，但是必须进行上市后数据的监测。该原则的提出是基于大样本数据的前提下，目前，国内产品的临床性能并无基于大样本的确切性验证，故需要通过随访，以达到CFDA要求，即在30岁及以上的NILM人群中，检出至少60例的CIN2＋来确定产品的临床性能。
(3)评估联合筛查可不局限于NILM人群：目前，在更新的FDA原则中，虽然仅对NILM人群的研究设计进行了要求，但是，在分析时增加了细胞学异常的人群，原因如下：①在>ASC－US人群中进行HPV检测，其结果可能进一步保证了该产品的安全性；②根据临床常规，在>ASC－US人群中一般会有阴道镜的检查和活检结果，可纳入后直接分析；③2012年ASCCP指导原则指出，众多联合筛查中的实际应用组合需要更多的数据支持[12]。基于以上理由，我们推荐，对于≥ASC－US的人群进行阴道镜检查，并将全部人群纳入联合筛查的分析人群中。
综上，按照CFDA指导原则的要求，可以采用前瞻性研究设计，对同一个自然人群进行拟申报产品HPV和细胞学平行检测，通过至少3年细胞学随访，对初筛和联合筛查进行拟申报产品的临床性能验证。FDA指导原则也明确指出，可在同一个研究设计中完成ASC－US分流、HPV初筛和联合筛查的临床用途验证。两个指导原则不同点在于，FDA要求提供ASC－US人群分流功能的前瞻性数据；而CFDA原则规定ASC－US人群分流功能可以在横断面研究中完成，不需要进行随访研究。
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