胰腺癌是一种恶性程度非常高的消化系统肿瘤，发病隐匿、早期诊断率低、进展快、预后差，胰腺癌的周围神经浸润(PNI)被认为是导致胰腺癌预后不良的重要因素。胰腺癌神经浸润模型可以在复杂的肿瘤微环境下模拟胰腺癌神经浸润的发生、发展过程，是研究胰腺癌PNI的分子机制、早期诊断和改良治疗方法的重要载体。PNI模型可以大致分为体内模型和体外模型，体内模型又可以分为异位模型和原位模型。近年来，在体外模型和体内模型基础上，又出现了基因工程小鼠模型、人源化肿瘤异种移植模型。文章分析了常用的胰腺癌神经浸润体外及体内模型的制备方法、临床用途和局限性。
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胰腺癌是一种恶性程度非常高的消化系统肿瘤，其发病隐匿、早期诊断率低、进展快、预后差。美国恶性肿瘤统计数字显示，胰腺癌病死率在男性和女性中均位居第4位[1]。目前，胰腺癌总体的治疗效果和术后5年生存率并无突破性进展，而胰腺癌的神经浸润被认为是导致胰腺癌预后不良的重要因素。
Liebig等[2]将周围神经浸润(perineural invasion, PNI)定义为周围神经由神经外膜、神经束膜和神经内膜3层膜覆盖，肿瘤细胞浸润3层神经鞘结构中的任意一层或肿瘤细胞包绕神经外周周长的1/3即被称为PNI。Schorn等[3]分析了胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)的总生存、无病生存和无进展生存情况，结果显示，PNI为独立的预后因素。尽管我们认识到了PNI的临床意义，也进行了很多研究，但仍未能全面了解PNI的具体机制，且缺乏针对PNI的具体治疗方案。
最初研究者认为，PNI仅仅是简单的淋巴转移的延伸，但最终被证实该理论并不成立。目前，PNI有以下几种学说：(1)低阻力通道学说：该学说认为，大部分肿瘤沿着神经内膜下含有液体的空间，少部分沿着神经组织内的淋巴系统侵袭，从而导致PNI的发生。(2)癌细胞-神经相互作用学说：该学说认为，肿瘤细胞有趋向神经生长的特性，被称为神经向性；同时，肿瘤细胞分泌一些因子促进神经轴突向肿瘤组织生长，该学说认为，PNI是肿瘤和神经之间相互作用、相互诱导产生的[4]。(3)神经重塑和瘤神经生成学说：该学说认为在慢性胰腺炎和胰腺癌组织中，由于炎症和(或)肿瘤细胞对神经的破坏，引起了神经的形态学改变。此外，慢性胰腺炎和胰腺癌均有营养神经的作用，这两方面的作用造成神经密度增大、神经肥大以及神经重塑，从而产生神经病性疼痛和特异性的胰腺神经病变。除了以上的学说外，近年来，上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)与肿瘤侵袭关系的研究受到普遍关注，EMT是指在特定的生理和病理情况下上皮细胞向间质细胞产生转化的现象，EMT在胰腺癌PNI中起到重要作用[5]。
目前，PNI的研究重点为慢性炎性微环境、高糖微环境和缺氧微环境，构建体内外实验模型模拟癌细胞在人体内的发展过程[6]。通过这些胰腺癌PNI模型的研究，探讨PNI所涉及的理论机制，这有助于开发出抑制人体自身PNI的靶向治疗药物，且减轻由PNI引起的疼痛，改善胰腺癌患者的预后。PNI模型可以大致分为体外模型和体内模型，其中体内模型根据原发肿瘤是否位于胰腺又可以分为异位模型和原位模型。目前，又新出现了基因工程小鼠模型和人源化异种移植模型(patient-derived xenograft, PDX)。我们就常用的胰腺癌神经浸润体外及体内模型的制备方法、临床用途和局限性进行阐述。
1997年，Tonge等[7]使用matrigel基质胶在体外不添加生长因子的情况下，成功培育了小鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)，自此建立了体外共培养模型。2011年，Ayala等[8]构建了一种PNI体外模型，其中DRG和人前列腺癌细胞(Du-145，LNCaP，PC3)和基质细胞(HTS-40F)在Matrigel基质中共培养，该模型主要模拟单个神经纤维和癌细胞在PNI中的相互关系。通过该模型，Ayala等[8]发现在前列腺癌细胞DU-145与单个神经纤维共培养的条件下，当神经突与DU-145细胞接触时，神经突的生长随即锐减，且DU-145细胞开始沿着神经突逆向生长[9]。我国学者使用小鼠DRG与Capan-2人胰腺癌细胞系在体外环境下共培养，发现胶质细胞源神经营养因子具有促进胰腺癌细胞增殖分化和趋化作用[10]。此外，研究者还构建了大鼠迷走神经组织与腔室系统相结合的PNI体外模型。具体过程是：在无菌条件下，解剖约5 mm的大鼠迷走神经子宫颈部分，将其放在特别设计的腔室底部0.7 mm的间隙内。然后将整个容器放置在含有标准培养基的组织培养板上。将PDAC细胞系进行胰蛋白酶消化，并使其悬浮于培养基中，将这些细胞悬浮液倒入容器中。通过这种方法，胰腺癌细胞可以通过腔室底部侵入神经并通过神经到达培养板。在2～3周后，培养板上出现单个细胞时，移除腔室并培养侵入细胞。将该过程重复多次，就可以获得具有神经浸润特性的胰腺癌细胞传代，可对这些细胞进行免疫组化研究[11]。也有学者使用小鼠之外的动物来研究PNI，如Romano等[12]使用从E9小鸡胚胎中分离出的DRG作为培养对象，并以此通过细胞外基质微环境来研究在PNI中细胞与基质和细胞与细胞之间的相互作用。
体外模型可以通过控制实验条件来了解单因素或多因素变量在促进PNI中所发挥的作用。但是这种模型经过连续传代之后，肿瘤细胞系已适应了培养皿的生长环境，同时肿瘤的异质性也会发生改变，并且各个胰腺癌细胞系在生长、浸润和转移等方面的特性也不一样，这些均会对实验结果产生影响。
Pour等[13]对去胸腺裸鼠背部皮下注射GALR2过表达的肿瘤细胞，14 d后处死裸鼠，在实验组中取3个明显的肿瘤，与对照组一起进行免疫组化和PNI的分析。此外，小鼠坐骨神经模型常常用于体内PNI的研究。坐骨神经容易解剖游离，可以将癌细胞在显微镜下注射到坐骨神经的神经束膜，远端可直达胫神经和腓总神经分叉处，癌细胞会侵袭到脊髓，导致后肢麻痹，然后定期观察，通过检测小鼠的粗略行为、后肢肌力和坐骨神经功能指数等来完成对PNI的评估。此外，也可以定期对坐骨神经行MRI和彩超等检查以明确PNI的进展情况。
异位模型优点是建模简单、有效，而且基本保留了原发肿瘤的生物学特征，可以通过异位模型反映出肿瘤在体内生长和浸润的部分特性，但是其缺点是不能充分地模拟胰腺癌周围复杂的肿瘤微环境，而且动物模型内的免疫调节与人体内的免疫调节差异也会导致药物临床效果的偏差，这些均限制了异位模型的进一步发展。
原位模型是将癌细胞在原位器官进行培养，在20世纪就已出现。Scanlon等[14]应用非侵入性胰腺癌的原位模型来研究PNI，他们将萤光素酶标记的胰腺癌细胞悬浮于Matrigel中，并通过剖腹手术将其注射至小鼠胰尾。在正常体温的条件下，Matrigel会发生固化，这阻止了其在注射期间癌细胞向腹腔的渗漏。在注射荧光素后，通过使用体内成像技术，定时监测从癌细胞发射出来的生物光来观察原发性肿瘤生长和转移情况。同理，体内成像技术也可用于跟踪原发性肿瘤切除后的复发情况。该原位模型可用于临床前动物实验，以研究新型抗癌药对原发性胰腺肿瘤生长和转移的影响。Gil等[15]应用这种方法慢性应激可以加速胰腺癌的PNI。此外，Tsuji等[16]将被红色荧光蛋白转染的人胰腺癌细胞直接注入小鼠胆总管，并使用奥林巴斯OV100全鼠成像系统观察，结果显示，5 d后肿瘤集落在胰管中成像，14 d后发现肝转移，28 d后肿瘤包绕整个胰腺。
基因工程小鼠模型属于原位模型的一种，是指利用启动子对模型小鼠的基因靶向敲入或敲除，使致癌基因快速诱导模型小鼠产生肿瘤，由于基因工程小鼠模型可以很好地模拟胰腺癌由癌前病变逐渐侵袭、转移的过程，最近受到了越来越多的关注。2004年，Braun等[17]发现内源性小鼠基因K-ras(G12D)蛋白可以快速诱导恶性骨髓增生性疾病，且有100%的外显率，这使得在临床研究中使用体内致癌模型成为可能。使用基因工程KPC小鼠可以表达K-ras、Tr-p53等条件突变等位基因，通过免疫荧光标记建立可视化的肿瘤模型，便于观察肿瘤大小、位置和疾病严重程度，进而了解疾病的进展情况。Stopczynski等[18]对小鼠模型的肿瘤进展程度制定以下分级标准：(1)靠近动物背部可见轻微痕迹；(2)明显的弓身姿势和轻微的立毛；(3)中度的弓身姿势和立毛；(4)严重的背部隆起、立毛和非常有限的自主活动。神经系统参与到了肿瘤形成的各个阶段，甚至包括肿瘤形成之前的阶段。
Amit等[19]使用转基因Pdx-1-Cre/K-ras G12D/p53 R172H(KPC)的小鼠肿瘤模型，对KPC小鼠的肿瘤进行免疫标记，使用专业的软件对PNI程度进行分析，并请病理学专家对PNI进行评分。研究者将神经入侵程度进行分类加权，使得神经浸润得以量化和比较，结果显示，RET在胰腺癌的发生过程中活化诱导PNI。Doiron等[20]描述了一种新型的胰腺癌实验模型，将含有致癌基因的慢病毒注射入成人野生型小鼠胰腺导管内，致癌基因编码KrasG12D突变和shRNA p53。慢病毒载体也共表达荧光素酶基因，他们用Xenogen IVIS成像系统通过生物发光进行体内成像。注射后数周的野生型小鼠具有与人胰腺混合腺泡导管癌相同的组织学特征。这种模型不涉及转基因小鼠或基因敲除小鼠模型中所固有的胚胎发育改变，且该模型完整保留了肿瘤的遗传学和组织学特性，而且还可以在体外方便地观察肿瘤的发生发展、浸润和转移情况，因此，这种新模型在测试新的抗癌药物时会更加有效。
随着人类对K-ras、p53基因认识的逐渐深入[21]，有学者提出把基因工程小鼠模型应用于预防恶性肿瘤的研究中，以期达到肿瘤的早期发现，这预示着肿瘤预防正在走进精准医疗时代[22]。
PDX模型是最近新开发的一种临床前模型，该模型直接将患者新鲜的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，既可以属于原位模型，也可以属于异位模型(通常位于皮下)。因此，PDX模型拥有和人类肿瘤组织极高的相似度，可以很好地预测临床疗效。Hoffman和Bouvet[23]为胰腺癌患者开发了一种多色可成像的原位PDX模型。通过将表达绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和青色荧光蛋白的转基因裸鼠多次原位传代标记肿瘤，同时这些有色转基因小鼠中的肿瘤片段标记肿瘤的基质细胞，他们通过端粒酶依赖性腺病毒OBP-401用绿色荧光蛋白原位标记PDX中的癌细胞，使得癌细胞和周围基质细胞均得以显现出不同的颜色。多色可成像的PDX模型可以为患者提供个性化肿瘤治疗供体，可以监测细胞变化从而评估靶向药物的疗效。
在临床治疗方面，Gao等[24]建立了约1 000个PDX模型，其具有多种驱动突变。他们对这些模型使用1×1×1实验设计(1个动物、1个模型、1个治疗)在体内进行了复合筛选，以评估在6种适应证下62种治疗的群体反应，结果表明，PDX临床治疗模型可能在评估一些治疗方式方面比细胞系模型更准确。这种临床前评估的实验方式可能有助于改善临床治疗方式，并提高预测临床试验反应的能力。
在临床前耐药性实验方面，Zhang等[25]收集了28例胰腺癌患者的肿瘤标本，建立了PDX模型。其异种移植物的成瘤率为100%，其中几个异种移植物可以重新植入裸鼠中10余次，从而进一步从PDX异种移植物获得原代细胞以确定其形态特征并评估其增殖速率、迁移能力和血管生成能力。MCF2L在吉西他滨耐药性中起重要作用，原代细胞和PDX异种移植与吉西他滨的敏感性有关。这说明PDX异种移植模型的可重复性以及在预测临床试验反应、临床药物耐药性等方面的可行性，同时通过国际联合的临床试验和人源化小鼠策略(如插入人源基因至小鼠基因ATG位点、替换整个外显子等)的实施，PDX模型所预测的临床结果将会越来越精确。
迄今为止，基因工程小鼠模型对于研究PNI在肿瘤的发生发展过程中所起的作用最有帮助。这种模型最明显的优势是完整保持了动物体内的神经微环境，使肿瘤细胞系自然浸润神经且不受人为因素的干扰，但是其突变从起始阶段就开始发展，并且在免疫缺陷小鼠中，不管是在无胸腺裸鼠(T细胞功能缺陷)、T细胞和B细胞联合免疫缺陷小鼠还是多联免疫缺陷型小鼠(T细胞、B细胞和NK细胞功能缺陷)中，其免疫系统均无法模拟真实的人体免疫系统，未来可以考虑在小鼠人源化免疫系统方面做一些改进。
随着PNI模型的不断进展，可供我们选择的模型越来越多，各种模型各具优势，我们可以根据不同的实验目的和实验条件来选择合适的实验模型。体外模型可以精确地控制实验条件，但是目前尚无哪种细胞系可以代表胰腺癌中的全部突变，而且体外模型缺乏肿瘤微环境，经过连续传代后，肿瘤异质性容易发生改变。体内异位模型虽然保留了肿瘤的基本特征，但是未模拟正常的肿瘤微环境。基因工程小鼠模型完整地保留了肿瘤微环境，是目前研究应用最广泛的模型，但基因工程小鼠模型制作难度大，小鼠多次传代后容易发生遗传突变。PDX模型可以广泛应用于临床治疗和耐药性实验，但是移植的肿瘤需要达到一定的量，通常只能通过手术切除获得，这可能无法使大多数晚期胰腺癌患者受益。而且建立药物检测PDX模型是一个漫长而昂贵的过程，胰腺癌患者病情发展迅速，患者通常难以经受如此漫长的等待；而且PDX模型含有某些异常的跨物种配体-受体相互作用，这些都会对实验结果造成影响。
在体内外模型研究中，有几个问题需要说明：(1)虽然几个体外模型在凝胶测定法的基础上使用细胞外基质(ECM)，但是不应低估ECM组成成分，如纤连蛋白、层粘连蛋白和亚型胶原等诱导细胞迁移的能力[26]。因此，在对PNI趋化因子的研究中，需要排除大量的ECM蛋白作为混杂因素的干扰。(2)有研究表明，在使用体内模型系统时，神经刺激可能会增加肿瘤发生和转移的概率，对小鼠进行注射等操作其本身也可能对实验结果是一个干扰因素[27]。(3)小鼠胰腺与人类胰腺差异巨大，小鼠胰腺在小肠系膜上像树枝一样弥散分布，可以大致分为十二指肠叶、脾叶和胃叶，且各叶之间有大量的结缔组织。更重要的是小鼠的PDAC来自外分泌腺泡细胞，而不是导管细胞，人类胰腺在腹膜后有许多神经丛包绕，但目前很少有针对小鼠胰腺周围神经丛的研究[28]。
目前，基因工程小鼠模型对于研究PNI在肿瘤的发生发展过程中所起的作用最有帮助，PDX模型则有可能作为患者的替身在精准治疗领域广泛应用，我们希望通过对PNI模型的研究，发现用于抑制临床胰腺癌进展和复发的药物，同时也为治疗胰腺癌PNI引起的神经性疼痛提供新的药物和方法。
所有作者均声明不存在利益冲突
