利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑，评价其抑制EV71复制的效应。
针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞毒性，转染后接种病毒观察细胞病变作用(CPE)，荧光定量RT-PCR法检测EV71含量，免疫共沉淀结合荧光定量RT-PCR法测定Cas9-gRNA在细胞内与EV71 RNA特异性结合的能力。
成功构建pCas-Guide-GFP-G1表达质粒；转染细胞后未见明显细胞毒性效应；细胞转染后接种病毒发现pCas-Guide-GFP-G1＋PAM1组细胞病变明显少于其他对照组；培养上清中EV71含量较对照组降低了40.4%(P＝0.056)，细胞中EV71含量较对照组降低了52.8%(P＝0.014)；pCas-Guide-GFP-G1＋PAM1组在细胞内与EV71 RNA特异性结合能力最高。
针对EV71的VP4基因设计的CRISPR/Cas9表达质粒在特定PAM存在下能通过对EV71基因组的剪切实现抑制EV71病毒复制的作用，可以为EV71治疗提供新的途径。
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肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是引起手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原体，可致神经系统疾病，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、小脑脑炎、急性弛缓性瘫痪等，导致患者终身瘫痪，甚至死亡[1,2]。手足口病是儿童常见病，20世纪以来，EV71感染引起的HFMD高发病率及病死率已引起了全社会的关注[3]，对公共健康安全造成了巨大威胁。然而，目前还缺乏针对EV71的特异治疗药物。近年来，基因修饰技术已逐渐成为一种重要的抗病毒治疗手段。2012年，一种新的基因编辑技术—CRISPR/Cas9技术引起了人们广泛关注，该技术由成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated sequences，Cas)组成，该系统能精确降解或沉默目的DNA[4]。利用该技术已成功对多种DNA病毒进行了编辑，抑制病毒的复制[5,6]。由于Cas9作用的底物为DNA而非RNA，CRISPR/Cas9编辑系统作用的均是基因组为DNA的病毒，对于RNA病毒的编辑剪切还不能实现。Ⅲ-B型CRISPR/Cas可作用于RNA靶标[7,8]。然而，该类型CRISPR/Cas系统构成比较复杂，不适合细胞内基因操作。利用简单快速的CRISPR/Cas9系统对RNA进行定点剪切是较为理想的手段。最近的研究取得了令人振奋的突破，通过对CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，在含特异性的原间区毗邻序列(protospacer adjacent motif，PAM)的DNA片段存在情况下，该系统在细胞外实验中实现了对RNA的定点识别和剪切[9]。
