郑宝璐; 高鑫; 庄志超; 苏承; 邹明; 于爱萍; 谭昭麟; 李晓燕

doi:10.3760/cma.j.cn112309-20210519-00165

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• 新型冠状病毒专题 •

天津滨海新区本土疫情新型冠状病毒全基因组测序和溯源分析

中华微生物学和免疫学杂志, 2021,41(8) : 581-587. DOI: 10.3760/cma.j.cn112309-20210519-00165

摘要

目的

对引起天津滨海新区本土新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)疫情的新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)进行全基因组溯源及变异情况分析。

方法

对2020年11月7日至12月5日采集的天津滨海新区新冠肺炎疫情1例本地无症状感染者和5例确诊病例咽拭子样本进行全基因组高通量测序，De novo拼接测序数据，使用MAFFT v7.0多重序列比对程序和MEGA X软件对上述数据进行比对和构建系统进化树(Neighbor-joining法)。

结果

6株新冠病毒序列与武汉参考序列(Wuhan-Hu-1)基因相似度均大于99.9%；6株病毒中2株基因完全相同，符合L基因型欧洲家系分支Ⅱ.1(北美分支)/B.1特征；另外4株基因完全相同，符合L基因型欧洲家系分支Ⅰ/B.1.1特征，此6株新冠病毒序列分属不同的进化分支，为两条不同的传播链。6株新冠病毒序列共有18个核苷酸突变位点，其中8个位点是同义突变，9个位点为错义突变，产生9个氨基酸突变位点，均发现RdRp-P323L、S-D614G重要变异位点。

结论

本研究中天津滨海新区新冠肺炎疫情为两起事件，6株新冠病毒序列分属不同的进化分支，为两条不同的传播链。提示可能来源于搬运工人接触了已污染新冠病毒的不同来源进口冷链物品。6株新冠病毒序列均有P323L、D614G突变，病毒突变、传播能力更强，应持续加强天津冷链重点从业人员及本土、输入性病例的监测。

引用本文: 郑宝璐, 高鑫, 庄志超, 等. 天津滨海新区本土疫情新型冠状病毒全基因组测序和溯源分析 [J] . 中华微生物学和免疫学杂志, 2021, 41(8) : 581-587. DOI: 10.3760/cma.j.cn112309-20210519-00165.

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新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)疫情给全球带来了严重的冲击和挑战。中国举全国之力，迅速遏制住了疫情的扩散，开创了中国防疫模式。而在国内疫情趋于稳定的时候，与冷链运输的冷冻产品有关的疫情时有发生，如北京新发地疫情、大连疫情、青岛疫情等。再回顾国内最初的武汉早期疫情，患者也主要集中在华南海鲜市场的冷冻海产品区域。2020年11月，天津滨海新区也先后发生了两起与冷链运输相关的新冠肺炎疫情。新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)为有包膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科β属，基因组全长大约为29.9 kb，共编码14个开放阅读框(ORF)的27个蛋白质，包括15个非结构蛋白、8个附属蛋白和4个主要结构蛋白(刺突糖蛋白S、基质蛋白M、包膜蛋白E和核衣壳蛋白N)^[1,2]。本研究应用二代测序技术对6份滨海新区疫情新冠病毒核酸阳性标本进行了病毒全基因组序列测定、组装和分析，为本地疫情流行病学调查和病原快速溯源提供参考。

材料和方法

样本来源：

从2020年11月7日至12月5日滨海新区疫情11例本地无症状感染者和确诊病例咽拭子中选取Ct值小于33的6例样本(样本编号为TJnCoV-FH138～TJnCoV-FH143)。

病例信息：

2020年11月7日，天津滨海新区接到山东德州通报，经我市从境外进口的德国猪肘外包装标本新冠病毒核酸检测呈阳性。经过对流入地A冷库连夜排查，1名A冷库装卸工人(TJnCoV-FH138)和一名曾到A冷库拉货的货车司机(TJnCoV-FH139)核酸检测阳性。11月10日上午，在全市冷链从业人员和冷冻货品核酸检测排查中，滨海新区东疆港1名冷链从业人员确认为无症状感染者(TJnCoV-FH140)，这名人员所搬运的冷链物品曾与天津之前接到山西太原通报的外包装新冠病毒核酸检测阳性的印度冷冻带鱼在同一货船。随后此人的2名室友工友以及同小区6名居民陆续新冠病毒核酸检测结果为阳性。

仪器与试剂：

病毒DNA/RNA提取试剂盒，DNA/RNA核酸自动提取系统购自西安天隆科技有限公司；新冠病毒核酸检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司；ABI 7500 Fast实时荧光PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific Inc；ULSEN^®超灵敏新冠病毒全基因组捕获试剂盒购自北京微未来科技有限公司；AMPure XP kit购自美国Beckman Coulter公司；Nextera^®XT DNA文库制备试剂盒购自美国Illumina公司；Miniseq™测序仪购自美国Illumina公司。

病毒核酸提取及实时荧光定量PCR检测：

在病毒DNA/RNA提取试剂盒加样孔中加入250 μl样本，并按照程序使用DNA/RNA核酸自动提取系统提取样本总RNA。按照新冠病毒核酸检测试剂盒说明书配制反应体系，加入样本核酸，在ABI 7500 Fast实时荧光PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测。

病毒RNA逆转录构建cDNA文库及全基因组测序：

使用ULSEN^®超灵敏新冠病毒全基因组捕获试剂盒，多对扩增引物，Invitrogen™ SuperScript™ Ⅲ ONE-STEP RT-PCR扩增体系，扩增出新冠病毒的全基因组。使用AMPure XP kit对PCR产物进行纯化并用Nextera^® XT DNA文库制备试剂盒构建新冠病毒全基因组测序文库，Miniseq™测序仪(Illumina，美国)进行双端测序。

病毒全基因组测序分析：

使用CLC genomics workbench20.0.3(Qiagen，德国)软件对Miniseq™测序仪处理后的样本基因组数据进行De novo拼接，使用MAFFT v7.0多重序列比对程序和MEGA X软件对上述数据进行比对和构建系统进化树(Neighbor-joining法)。以新冠病毒Wuhan-Hu-1(GenBank数据库：NC_045512.2；GISAID数据库：EPI_ISL_402125)为参考序列，其他新冠病毒基因组序列下载自GISAID(Global Initiative of Sharing All Influenza Data)新冠病毒基因数据库。

结果

1．病毒全基因组测序：

本研究6例样本经高通量序列测定和De novo序列拼接，基因长度为29 643～29 958 bp,全基因组序列基因测序覆盖度为99.28%～99.83%，平均测序深度为1 214×～7 597×。6株新冠病毒序列和武汉参考序列相比基因同源性均大于99.9%，其中TJnCoV-FH138和TJnCoV-FH139的新冠病毒序列基因相似度为100%；TJnCoV-FH140、FH141、FH142和FH143的新冠病毒序列基因相似度为100%。

2．病毒全基因组变异位点结果与分析：

同武汉参考序列(Wuhan-Hu-1)相比，此6株新冠病毒序列共有18个核苷酸突变位点，其中8个位点是同义突变，9个位点为错义突变，产生9个氨基酸突变位点(表1)。而6株均有C14408T/ORF1ab-P4715L(RdRp-P323L)、A23403G/S-D614G这两个重要突变位点。

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表1

6株新冠病毒基因组核苷酸及氨基酸变异情况

Table 1.

Analysis sequences genomic nucleotide and amino acid variations of six SARS-CoV-2 isolates

表1

6株新冠病毒基因组核苷酸及氨基酸变异情况

Table 1.

Analysis sequences genomic nucleotide and amino acid variations of six SARS-CoV-2 isolates

基因区域	碱基突变位点	氨基酸突变位点	氨基酸突变类型
5′UTR	C241T	-	-
ORF1ab	C313T	L16L	同义突变
ORF1ab	G376A	E37E	同义突变
ORF1ab	C601A	G112G	同义突变
ORF1ab	C1059T	T265I	错义突变
ORF1ab	C3037T	F924F	同义突变
ORF1ab	C4965T	T1567I	错义突变
ORF1ab	C5700A	A1812D	错义突变
ORF1ab	C14408T	P4715L	错义突变
ORF1ab	T15254C	V4997A	错义突变
ORF1ab	C18657T	T6131T	同义突变
S	A23403G	D614G	错义突变
ORF3a	G25563T	Q57H	错义突变
M	C26625T	L35L	同义突变
N	G28881A	R203K	错义突变
N	G28882A	R203R	同义突变
N	G28883C	G204R	错义突变
N	G29254T	S327S	同义突变

同武汉参考序列(Wuhan-Hu-1)相比，TJnCoV-FH138和TJnCoV-FH139的新冠病毒序列核苷酸突变位点完全相同，共享9个相同的变异位点。TJnCoV-FH140、FH141、FH142和FH143的新冠病毒序列核苷酸突变位点完全相同，共享13个相同的变异位点。TJnCoV-FH138、FH139与TJnCoV-FH140、FH141、FH142、FH143的新冠病毒序列仅有4个相同的变异位点(图1)。

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图1

6株新冠病毒基因组变异位点

Fig 1.

Genomic mutation locations in six SARS-CoV-2 isolates

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图1

6株新冠病毒基因组变异位点

Fig 1.

Genomic mutation locations in six SARS-CoV-2 isolates

3．系统发生树分析：

将测得的6株新冠病毒序列和在GISAID等已公开的全球新冠病毒基因组数据库中下载的126条序列以Neighbor-joining法构建系统发生树。根据我国新冠病毒分型^[3]和Pangolin分型法^[4]，TJnCoV-FH138和TJnCoV-FH139的新冠病毒序列6个核苷酸突变位点(C241T、C1059T、C3037T、C14408T、A23403G和G25563T)符合L基因型欧洲家系分支Ⅱ.1(北美分支)/B.1特征；与2株加拿大于2020年3月流行的毒株序列(GISAID IDs：EPI_ISL_586371 、EPI_ISL_469240)共享其7个核苷酸突变位点(包括L基因型欧洲家系分支Ⅱ.1特征的6个核苷酸突变位点和1个天津特征性突变位点C4965T或C26625T)，提示存在较强的亲缘关系。TJnCoV-FH140、FH141、FH142和FH143的新冠病毒序列7个核苷酸突变位点(C241T、C3037T、C14408T、A23403G、G28881A、G28882A和G28883C)符合L基因型欧洲家系分支Ⅰ/B.1.1特征，与印度2020年7月流行的4条序列(GISAID IDs：EPI_ISL_586549、EPI_ISL_586550、EPI_ISL_586557和EPI_ISL_586558)亲缘关系最近，共享其12个核苷酸突变位点，仅缺少一个突变位点(G29254T)，高度同源(图2)。

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图2

6株新冠病毒全基因组序列系统发生树

Fig 2.

Phylogenetic trees of six SARS-CoV-2 isolates genome sequences

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注：红色与绿色★标注为天津滨海新区本土6株新冠病毒

图2

6株新冠病毒全基因组序列系统发生树

Fig 2.

Phylogenetic trees of six SARS-CoV-2 isolates genome sequences

根据基因序列分析结果，样本编号为TJnCoV-FH138和TJnCoV-FH139的新冠病毒序列与样本编号为TJnCoV-FH140、FH141、FH142和FH143的新冠病毒序列分属不同的进化分支，为两条不同的传播链。

讨论

本研究共获得6株新冠病毒序列，分析结果显示TJnCoV-FH138和TJnCoV-FH139的新冠病毒序列与TJnCoV-FH140、FH141、FH142和FH143的新冠病毒序列分属不同的进化分支，为两条不同的传播链。6株新冠病毒序列与当前全球新冠数据库比对发现，分别与加拿大、印度的基因序列有较强亲缘性，与全国既往报告的本地病例、与后来全球关注的热点Alpha变异株(B.1.1.7分支)和Beta变异株(B.1.351分支)基因上都不存在关联。结合流行病学调查分析，提示天津这2个病毒传播链的病毒可能来源于搬运工人接触了已污染新冠病毒的不同来源进口冷链物品，判断为两起疫情事件。

新冠病毒突变率相对较高，主要与极低校对活性的RNA依赖RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)有关^[5,6]，关注新冠病毒基因变异对全球防疫十分重要。滨海新区6株新冠病毒序列共有18个基因突变位点，均发现有C14408T/ORF1ab-P4715L(RdRp-P323L)突变。SARS-CoV-2的RdRp可催化病毒RNA的复制，因此，RdRp基因的一个关键突变有可能改变病毒的复制能力，RdRp的突变可能有助于提高病毒的传染性和疾病的严重性。Pachetti等^[7]研究发现SARS-CoV-2基因组存在的RdRp-P323L突变与病毒基因组整体突变率升高有关。Biswas和Mudi^[8]发现S-D614G和RdRp-P323L突变在COVID-19重症中占主导地位。

在本次6株新冠病毒序列中均出现S蛋白上的D614G突变。新冠病毒S蛋白是分布在病毒颗粒表面的主要跨膜糖蛋白，负责将病毒附着到其细胞受体(血管紧张素转换酶2, ACE2) ，宿主蛋白酶对S糖蛋白的裂解是病毒粒子进入靶细胞的必要条件^[6,9]，S1亚基中的受体结合域(receptor-binding domain, RBD)与ACE2结合，促进与宿主细胞膜等融合^[10]。而S糖蛋白的S2结构域，其功能有助于病毒与宿主细胞膜的融合^[11]。从免疫和进化的角度来看，研究SARS-CoV-2编码S蛋白的基因引起了特别的关注，所以S蛋白是当前疫苗策略和抗病毒治疗的主要靶点^[12]。S-D614G突变首次在德国报道后迅速传播到全世界^[13]，由于我国严格的防疫政策，在GISAID数据库中发现早期我国本土病例均无D614G变异，后期在国内因冷链传播导致的疫情和境外输入病例中大部分发现有D614G变异位点。在全球的高频率表明，该变异病毒比携带D614G的病毒更有效地在人与人之间传播^[14]。Plante等^[15]在一项新的研究中证明D614G增强了新冠病毒在上呼吸道的复制，增加了新冠患者上呼吸道的病毒载量，并可能提高了传播能力。而从机制上，D614G取代消除了刺突蛋白三聚体的邻近原聚体与T859之间的氢键相互作用，削弱了三聚体的稳定性，从而变构将RBD转移到"上"构象，促进与ACE2受体的结合，导致增强病毒粒子的感染性，其中包括D614G替换可能会改变病毒构象可塑性，因此获得潜在的病毒适应性^[14,16]。另外有3项研究^[17,18,19]表明D614G突变不会损害基于S-D614疫苗诱导的抗体的中和活性，并不显著影响现有疫苗的有效性。

2021年全球新冠病毒肺炎疫情依然十分严峻，我国疫情仍处于零星散发状态，局部地区时有严重的聚集性疫情。本次天津本土疫情，通过全基因组高通量测序技术，第一时间获取病毒全部基因信息，精准的定位病毒的来源，捋清传播链，提供传播力、变异进化等分析结果，快速科学准确地为疫情溯源、流行病学调查、阻断传播途径、临床诊疗用药指明方向，帮助短时间内快速遏制疫情发展，在疫情防疫策略中起着至关重要的作用。未来我们会加强冷链行业重点从业人员的核酸检测工作，继续开展天津市本地病例和外来输入性病例新冠病毒全基因组测序工作，监测病毒变异进化情况，精准科学地为防疫工作保驾护航。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

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贡献者信息

郑宝璐

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

高鑫

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

庄志超

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

苏承

天津市疾病预防控制中心传染病预防控制室　300011

邹明

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

于爱萍

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

谭昭麟

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

李晓燕

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

通信作者

李晓燕

天津市疾病预防控制中心病原生物检测室　300011

Email：xiaoyanli1291@163.com

关键词

新型冠状病毒; 新型冠状病毒肺炎; 冷冻食品; P323L; D614G;

基金项目

天津市卫生健康委新冠肺炎防治科技项目（2020xkm01）

天津市科技计划项目（20JCZDJC00130）

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2021-08-31

收稿日期：2021-05-19

Novel Coronavirus

Complete genome sequencing and traceability analysis of SARS-CoV-2 in Binhai New Area, Tianjin

Zheng Baolu, Gao Xin, Zhuang Zhichao, Su Cheng, Zou Ming, Yu Aiping, Tan Zhaolin, Li Xiaoyan

Published 2021-08-31

Cite as Chin J Microbiol Immunol, 2021, 41(8): 581-587. DOI: 10.3760/cma.j.cn112309-20210519-00165

Abstract

Objective

To analyze the whole genome traceability and variation analysis of SARS-CoV-2 in local COVID-19 outbreaks in Binhai New Area, Tianjin.

Methods

The whole-genome high-throughput sequencing was performed on throat swab samples collected from one local asymptomatic infected person and five confirmed cases of COVID-19 in Binhai New Area of Tianjin from November 7 to December 5, 2020. The sequencing data were assembled by De novo. MAFFT v7.0 multiple sequence alignment program and MEGA X software were used to compare the above data and construct phylogenetic tree (Neighbor-joining method).

Results

The genetic similarity between the sequences of 6 SARS-CoV-2 strains and Wuhan reference sequence (Wuhan-Hu-1) was greater than 99.9%. Two of six strains were genetically identical, conform to the L-Lineage European Branch Ⅱ.1(America Branch)/B.1; The other four strains had the same genes and were in line with the characteristics of L-Lineage European Branch Ⅰ/B.1.1.These six strains belonged to different evolutionary branches and two different transmission chains. There were 18 nucleotide mutation sites in sequences of six SARS-CoV-2 strains, eight of which were synonymous mutation sites, nine of which were missense mutation sites, resulting in nine amino acid mutation sites, and important mutation sites of RDRP-P323L and S-D614G were found in all of the six samples.

Conclusions

In this study, there were two COVID-19 outbreaks in Binhai New Area of Tianjin, and the sequences of six SARS-CoV-2 strains belonged to different evolutionary branches and two different transmission chains. It might come from porters′ contact with imported cold chain items contaminated with SARS-CoV-2 from different sources. All the sequences of six SARS-CoV-2 strains had P323L and D614G mutations, which indicated that the virus mutation and transmission ability were stronger. The surveillance of important employees of the cold chain in Tianjin and local and imported cases should be continuously strengthened.

Key words:

SARS-CoV-2; COVID-19; Frozen food; P323L; D614G

Contributor Information

Zheng Baolu