对2019新型冠状病毒(2019-novel Coronavirus，2019-nCoV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)进行原核表达、纯化与鉴定，并应用于2019-nCoV血清学诊断。
合成2019-nCoV NP基因，克隆至pET28a载体中，构建表达质粒，并进行诱导纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、间接ELISA、Western blot(WB)、免疫层析法进行鉴定。优化间接ELISA反应条件，进行血清抗体检测。
重组NP经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳显示相对分子质量约50×103，与预期一致；间接ELISA、WB表明其能与2019-nCoV感染患者血清特异性结合；用免疫层析法发现对NP检测限为0.2 ng/ml；间接ELISA检测32份2019-nCoV感染者血清及对照血清，发现二者结果可见明显分群。
原核表达的NP具有良好的免疫原性，可用于制备血清学诊断试剂。
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2019年底至2020年初，2019新型冠状病毒(2019-novel Coronavirus，2019-nCoV)感染的急性肺炎首先在湖北武汉暴发，随即以极快的速度蔓延至全国所有省份[1,2]。其传染性强，传播途径广，特别是人传人的能力远超过2003年的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)[3]，引起世界卫生组织(World Health Organization，WHO)高度关注[4]。早期诊断是预防、控制2019-nCoV暴发的重要手段[5]。截止2020年4月初，我国新型冠状病毒疫情已经初步得到控制，但是境外疫情仍处于失控状态。研发血清学检测试剂，对感染现状评估及感染者诊断与排除具有重要意义。
2019-nCoV是单股正链RNA病毒，基因组大小约30 kb，与SARS-CoV相似性为79%，与蝙蝠体内分离的冠状病毒相似性最高约88%，是一种全新的感染人类并引起严重疾病的病毒[6,7]。2019-nCoV的核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可作为2019-nCoV感染血清学诊断的主要靶标抗原。
本研究以2019-nCoV NP作为研究对象，表达纯化了该病毒NP，并且进行了规模化生产，对该蛋白的免疫原性和在血清学诊断中的应用做了初步探讨。
2019-nCoV NP基因序列(GenBank序列号：MT066176.1)以及相关引物合成和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物系统(安徽)有限公司；鼠抗2019-nCoV NP多克隆抗体购自北京京天成生物公司；BamHⅠ和NotⅠ核酸内切酶购自New England Biolabs (NEB)公司；EX Taq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者血清由本中心收集及保存，全部为江苏省病例。
设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamHⅠ酶切位点，下游引物带NotⅠ酶切位点。引物序列(5'-3')为：Cov2-NP-F：CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC; Cov2-NP-R: ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增NP基因，PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 80 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经胶回收约1 300 bp目的片段，然后经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG，16 ℃诱导6 h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8 mol/L尿素中，然后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上100 L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1%甘油)，发酵参数为280 rpm，通气比为0.5 vvm(15 L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06 MPa～0.1 MPa，发酵温度为16 ℃，培养24 h。
将纯化NP按一定包被量包被至ELISA板中4 ℃过夜，次日用3% BSA封闭1 h后加入待测血清，从1∶100开始倍比稀释8个稀释度，37 ℃孵育30 min，然后PBST洗板后加入HRP标记抗人Fc抗体(1∶5 000)，孵育30 min后，PBST洗涤，TMB显色。
纯化NP经SDS-PAGE后，转印至PVDF膜中，用5%脱脂牛奶封闭1 h后，用患者血清(1∶500稀释)作为一抗，同时用健康成人血清作为阴性对照，室温孵育1 h，用HRP标记抗人Fc作为二抗室温孵育30 min，PBST洗涤后用DAB显色。
将鼠抗2019-nCoV NP多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上，形成T线，抗鼠IgG抗体标记至C线处。NP系列稀释后加50 μl于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微球的鼠抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处，与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。其余鼠抗体再继续迁移至C线处，与抗鼠抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏性。
从合成基因中扩增出NP全长基因，大小为1 260 bp，将此基因构建到pET28a载体中，利用载体N端的His tag进行纯化。NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计蛋白相对分子质量约50×103。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×103左右出现明显的条带。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150 mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的位置出现单一蛋白条带。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较高。
用间接ELISA检测NP与患者血清的结合特异性，结果显示NP能与患者血清明显结合，并且OD450值随稀释度递减，而阴性血清与NP反应不显颜色(图1A)。为了优化ELISA反应条件，依次选择不同浓度的NP进行包被，发现100 ng和50 ng包被量能与阳性血清发生明显的颜色变化而对照阴性血清OD值较低(图1B)。因此，选择100 ng作为最终包被浓度，并对32份确诊患者血清标本进行筛选，发现阴性和阳性标本有明显的分群(图1C)。
注：A. NP与血清间接ELISA结果；B.不同NP抗原包被量的ELISA结果；C. 100 ng包被NP量测病例与对照血清
Note: A. Identification of the binding specificity of NP by indirect ELSA；B. Optimal quantity of NP for coating; C. Using 100 ng NP to detect antibodies of patients and healthy person samples
纯化NP经SDS-PAGE后转印至PVDF膜后，与4例患者血清反应，用健康人血清作为对照。结果显示在相对分子质量50×103左右有明显的条带，与NP纯化后的相对分子质量大小一致(图2)。此结果进一步证明了纯化NP能特异性识别患者血清中相关抗体。
注：M.蛋白marker；1-4.待测患者血清样本；5.阴性成人血清
Note: M. Protein markers; 1-4. Four different patients serum samples; 5. Healthy person serum sample
采用有色微球标记抗体检测层析条对NP的检测限，NP经过系列稀释，用标记微球的鼠多抗检测。结果显示在稀释到0.2ng/ml时仍然能检测出明显的T线，此结果显示该NP能与鼠多抗特异性结合并且检测限可达到ng级别(图3)。
注：A为层析法检测NP；B为阴性血清对照；C质控线；T检测线
Note: A．To detect NP using immunochromatographic assay; B. Negative control samples; C. Control line; T. Test line
2019年12月在湖北武汉发现2019-nCoV感染病例，随即呈暴发趋势，并迅速扩散。为了防止疫情扩散，国内采取了一系列紧急应对措施，动员了空前的人力物力，虽然疫情发展势头得到有效遏制，但是国民经济受到了巨大的损失，人民生活也受到极大影响[8]。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。目前，2019-nCoV感染的诊断主要依赖于核酸诊断[9]。虽然核酸诊断速度快、受采样质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断特别是血清中IgM抗体的检测，同样也是早期诊断和感染现状评价的重要手段。
2019-nCoV属于β属冠状病毒，病毒核衣壳呈螺旋对称，理论上讲有更大的容纳核酸的空间，其核酸长度也比较长，达30 kb。病毒呈花冠状，其中明显的刺突蛋白(spike protein，SP)为表面蛋白，含有受体结合位点和中和抗体结合位点，承受机体免疫系统的压力。NP为包裹核酸的衣壳蛋白，在结构蛋白中含量比较高，且在病毒感染早期大量复制，可以引起强烈的免疫反应，是作为免疫诊断的理想靶抗原[10,11]。
本研究在疫情暴发早期就成功表达出2019-nCoV NP，并且用患者血清对此蛋白进行了一系列功能验证，建立了间接ELISA的方法用于血清抗体筛查，说明该蛋白具有良好的免疫原性，可以用于制备抗体诊断试剂。由于疫情初期收集到的感染病例血清盘数量有限，NP的特异性抗体检测方法的特异性仍有待进一步评价。
所有作者均声明不存在利益冲突
