探讨微小RNA-21-5p(miR-21-5p)在心肌梗死后心力衰竭中的作用及相关机制。
构建小鼠心肌梗死模型，利用实时荧光定量PCR方法分析梗死心肌中miR-21-5p的表达变化；构建miR-21-5p过表达慢病毒，通过在体感染合并心肌梗死小鼠模型，采用超声心动图及免疫组化方法明确miR-21-5p对心肌梗死后心肌纤维化、心力衰竭的影响；体外进行miR-21-5p慢病毒感染，采用细胞划痕试验及细胞计数检测明确miR-21-5p对心脏成纤维细胞功能的影响。
小鼠梗死心肌中miR-21-5p的表达是假手术组小鼠的1.75倍(t＝8.633，P<0.01)；与阴性对照组相比，miR-21-5p可导致心肌梗死后心功能进一步恶化(左室射血分数：31.62%±7.63%比42.69%±4.47%，t＝2.800，P＝0.02)，并加重梗死心肌纤维化程度(42.61%±6.73%比23.23%±4.07%，t＝3.470，P＝0.01)；miR-21-5p可下调Smad7表达(0.72倍，t＝3.432，P＝0.01)，促进心脏成纤维细胞的增殖(1.42倍，t＝5.855，P<0.01)和迁移能力(1.41倍，t＝6.658，P<0.01)。
miR-21-5p通过下调Smad7表达，增强心脏成纤维细胞的增殖和迁移能力，加重心肌梗死后心肌纤维化和心力衰竭。
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心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段，患者预后差，死亡率高。据估算，成年人心力衰竭的患病率约为1.5%～2.0%，而70岁以上人群的心力衰竭患病率则高于10%[1]。心肌梗死可引起心肌坏死、心肌纤维化，导致心室重构，是心力衰竭发生发展的重要病因[2,3]。尽管近年来心力衰竭的诊疗手段取得了诸多进展[4]，但心肌梗死后心力衰竭的分子发生机制仍未阐明，尚缺乏有效延缓甚至治愈心肌梗死后心力衰竭的有效手段。近期研究显示，微小RNA-21-5p(microRNA-21-5p，miR-21-5p)在肺、肾脏等诸多器官的纤维化过程中起重要的调控作用[5,6]。然而，miR-21-5p在心肌梗死后心力衰竭中的作用及机制尚不明确。本研究拟探讨miR-21-5p在心力衰竭中的作用，并对其作用机制进行阐释。
对照慢病毒(Let-vector)及miR-21-5p过表达慢病毒(Let-mir-21-5p)购自上海吉凯基因化学技术有限公司。青霉素-链霉素抗生素(Gibco™)、DMWM/F-12培养基(Gibco™)、胎牛血清(Gibco™)、0.25%胰酶-EDTA(Gibco™)、脂质体2000(Invitrogen)、Opti-MEM(Invitrogen)、TRIzol试剂(Invitrogen)、Taqman™ miRNA测试试剂盒等均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；2型胶原酶购自美国Worthington Biochemical Corporation公司；miRNA分离试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；AMV反转录试剂盒购自美国Promega公司；引物购自上海赛百盛基因技术有限公司。
实验动物采用8～10周雄性C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。通过结扎小鼠心脏冠状动脉前降支血管构建小鼠心肌梗死模型。即用1.0%～1.5%的异氟烷麻醉小鼠，进行气管插管，连接至小动物呼吸机上。自第4肋间打开小鼠胸腔，钝性分离心包壁层，用7-0的丝线结扎小鼠冠状动脉前降支，见结扎区域心肌组织颜色变白代表造模成功，并用5-0的丝线关闭胸腔。
于小鼠心肌梗死手术前1周，将阴性对照慢病毒或miR-21-5p过表达慢病毒通过尾静脉注射方式注入小鼠体内，每只小鼠给予病毒剂量为1.0×107 TU，每只小鼠给药体积为150 μl。慢病毒转染效率利用实时荧光定量PCR方法进行检测。
小鼠心肌梗死模型构建4周后，进行超声心动图检测以评价心脏功能，如左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)。超声心动图利用Vevo 2100小动物超声仪进行采集，探头型号为MS-400(富士胶片公司，加拿大)。
小鼠模型构建4周后，取小鼠心脏，固定于4%的多聚甲醛中，包埋，并切成5 μm厚度的切片。对切片进行Masson染色，利用显微镜(Olympus公司，日本)进行拍照，观察小鼠心脏纤维化程度。利用Image J软件对梗死交界区心肌纤维化程度进行定量分析。
取3 d以内的新生C57BL/6乳鼠心脏，将心脏剪成小块，置于0.08%的胰酶及0.05%的2型胶原酶混合液中，4℃消化过夜。利用含15%胎牛血清的DMEM/F-12培养基终止消化，1 000转/min离心10 min，并铺至培养皿中，1 h后进行换液，贴壁细胞即为原代心肌成纤维细胞。利用传代后2～3代细胞进行CCK-8及细胞划痕等功能实验。
将原代成纤维细胞置于含5 μg/ml的Polybrene与5×107 TU/ml的阴性对照慢病毒或miR-21-5p过表达慢病毒的15%胎牛血清DMEM/F-12培养基中24 h，更换培养基继续培养48 h以实现慢病毒转染。慢病毒转染效率用实时荧光定量PCR法检测。
利用TRIzol试剂及miRNA分离试剂盒，按照操作说明提取总RNA及miRNA。利用AMV反转录试剂盒和SYBR premix DimerEraser™进行cDNA第一链合成及mRNA表达半定量分析。利用TaqMan miRNA试剂盒检测miRNA表达量分析。实时荧光定量PCR应用StepOne™体系进行检测(Applied Biosystems，美国)。Smad7引物序列：前向引物：5’-GGCCGGATCTCAGGCATTC-3’；后向引物：5’-TTGGGTATCTGGAGTAAGGAGG-3’。
采用RIPA蛋白裂解液提取目标细胞或目标组织中的蛋白，利用BCA法进行蛋白浓度测定。在10%的SDS-PAGE凝胶中进行蛋白电泳(上样量均为20 μg)，并进行转膜、封闭，以1∶1 000的比例孵育Smad7、TGF-β及GAPDH一抗，4℃过夜；以1∶3 000比例室温孵育二抗1 h，并进行化学发光及显影。
利用IBM SPSS 22软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用
±s表示，两组间的差异通过Student's t检验进行分析。检验水准α取0.05。
制作小鼠心肌梗死模型及假手术组，于术后1周取小鼠心脏梗死组织，提取假手术组及心肌梗死组小鼠心脏miRNA，并通过实时荧光定量PCR检测梗死心脏中miR-21-5p的表达变化(以U6的参照)。结果发现，与假手术组(n＝5)相比，心肌梗死小鼠(n＝5)心脏miR-21-5p表达量明显上调，为假手术组的1.75倍(t＝8.633，P<0.01)。
阴性对照组和miR-21-5p过表达组小鼠冠状动脉前降支结扎术后4周，进行超声心动图检测，比较两组小鼠心脏功能变化情况。结果发现，与阴性对照组相比，miR-21-5p过表达组小鼠的LVEF(31.62%±7.63%比42.69%±4.47%，n＝5，t＝2.800，P＝0.02)和FS(15.16%±3.90%比20.98%±2.57%，n＝5，t＝2.788，P＝0.02)显著下降，心脏功能明显恶化，见图1。
慢病毒介导的miR-21-5p过表达可导致小鼠心肌梗死后心脏功能恶化。A：阴性对照慢病毒心肌梗死组(Let-vector-MI)与miR-21-5p过表达慢病毒心肌梗死组(Let-miR-21-5p-MI)小鼠心肌梗死模型建立后4周的M型超声心动图；B：两组LVEF比较；C：两组FS比较
将小鼠分为阴性对照组(Let-vector-MI)和miR-21-5p过表达组(Let-miR-21-5p-MI)，并分别制作心肌梗死模型。术后4周取心脏标本行Masson染色，比较梗死交界区心肌纤维化水平。结果发现，与阴性对照组相比，miR-21-5p过表达组小鼠心脏组织中miR-21-5p的表达水平显著上调(P＝0.01)；miR-21-5p过表达组小鼠梗死交界区心肌纤维化水平显著升高(42.61%±6.73%比23.23%±4.07%，n＝5，t＝3.470，P＝0.01)，见图2。
A～C：慢病毒介导的miR-21-5p过表达可导致小鼠梗死心肌纤维化水平显著增加；D：实时荧光定量PCR显示，miR-21-5p过表达慢病毒组小鼠心脏中miR-21-5p的表达量显著上调
培养原代心脏成纤维细胞，进行阴性对照慢病毒、miR-21-5p过表达慢病毒转染，CCK-8及细胞划痕实验验证miR-21-5p对心脏成纤维细胞功能的影响。结果发现，与阴性对照组相比，miR-21-5p过表达组小鼠心脏成纤维细胞中miR-21-5p的表达水平显著增加(1.66倍，n＝5，t＝3.126，P＝0.02)；miR-21-5p过表达明显促进心脏成纤维细胞的增殖(P<0.01)及迁移能力(P<0.01)，见图3。
A、C：细胞划痕实验显示，慢病毒介导的miR-21-5p过表达促进心脏成纤维细胞的迁移能力；B：CCK8实验显示，慢病毒介导的miR-21-5p过表达促进心脏成纤维细胞的增殖能力；D：实时荧光定量PCR显示，miR-21-5p过表达慢病毒组心脏成纤维细胞中miR-21-5p的表达量显著上调
我们通过TargetScan数据库，对miR-21-5p的靶基因进行分析，结果发现miR-21-5p可与Smad7的3’UTR区结合，具有调控Smad7表达的潜在作用(图4A)。通过提取阴性对照及miR-21-5p过表达心脏成纤维细胞的mRNA，进行实时定量荧光PCR，发现miR-21-5p显著下调Smad7的mRNA表达水平(0.72倍，n＝5，t＝3.432，P＝0.01，图4B)。另外，Western blot实验显示，miR-21-5p可下调Smad7的蛋白表达，并上调TGF-β的蛋白表达(图4C)。
A：miR-21-5p与Smad7 3’UTR区结合位点展示；B：miR-21-5p可下调Smad7的mRNA表达；C：miR-21-5p可下调Smad7的蛋白表达，并上调TGF-β的蛋白表达
心肌纤维化是心肌梗死后心力衰竭的关键致病因素，而心肌梗死后心肌纤维化形成的具体发病机制目前仍在研究之中[7]。研究显示，miR-21-5p在早期胚胎发育、哮喘、肿瘤发生等重要生理病理中发挥重要作用[8,9]。MiR-21-5p通过靶向Smad7的表达，调控TGF-β信号通路，促进胶原形成，参与到肺、肝及肾的纤维化过程中[5,6,10]。但miR-21-5p在心肌梗死后心力衰竭中的作用及相关机制的研究并未得到阐释。
本研究发现，梗死心肌中的miR-21-5p的表达水平明显上调，慢病毒介导的miR-21-5p过表达可导致心肌梗死后心力衰竭的程度进一步加重。考虑到miR-21-5p具有通过调控TGF-β信号通路，促进肝、肾等脏器纤维化的作用，我们同时对miR-21-5p过表达小鼠心脏纤维化水平进行了观察，结果发现miR-21-5p可显著增加梗死心肌纤维化的水平。因此，考虑miR-21-5p的致心力衰竭作用很可能与其促进心肌纤维化的作用有关。为明确miR-21-5p对心肌纤维化的作用机制，分离小鼠原代心脏成纤维细胞，并进行了细胞增殖和迁移功能检测。结果发现，miR-21-5p过表达明显促进了心脏成纤维细胞的增殖能力和迁移能力。可见，miR-21-5p参与了心肌纤维化过程，导致心力衰竭程度进一步加重。
Smad7是经典的TGF-β信号通路拮抗因子，其主要通过参与TGF-β信号通路发挥其抗纤维化作用[11]。既往研究显示，在肺脏及瘢痕纤维组织中，miR-21-5p可下调Smad7的表达，致使其抗纤维化能力受到抑制，从而促进纤维化的进程[6,12]。本研究结果显示，在心脏成纤维细胞中，miR-21-5p明显下调Smad7的表达水平，通过调控TGF-β信号通路，促进心脏成纤维细胞的增殖和迁移能力，是调控心肌梗死后心力衰竭的潜在发生机制。这一结果与既往研究一致，验证了miR-21-5p/Smad7信号轴在心肌梗死后心力衰竭中的作用。然而，也有学者认为，由于mRNA调控机制纷繁复杂，并可受到多个miRNA的调控，我们很难确定在疾病的发生发展过程中单个miRNA对mRNA的调控作用。因此，我们仍需开展更多的基础及临床研究，进一步明确miRNA调控mRNA的本质及其在各种疾病发生发展中的具体机制和作用。
本研究尚有一定的局限性。首先，本研究主要利用动物及细胞实验来证明miR-21-5p在心肌梗死后心力衰竭中的作用，并未在人群中进行验证；其次，由于人体心脏标本难以获取，本研究仅针对动物心脏组织中的miRNA表达变化及作用进行了研究；再次，本研究虽在动物及细胞水平证实了miR-21-5p的致心肌纤维化及心力衰竭作用，但将其作为临床诊疗的生物标记物或治疗靶点仍需进一步的基础及临床研究进行验证。
综上所述，miR-21-5p在调控心肌梗死后心力衰竭中发挥一定的致病作用。这一作用可能是通过miR-21-5p促进心脏成纤维细胞增殖和迁移能力，导致心脏纤维化来实现的。另外，miR-21-5p/Smad7信号轴是调控心肌梗死后心力衰竭的重要分子机制。这一研究为明确心肌梗死后心力衰竭的发生机制，探索新型临床治疗靶点提供了一定的理论依据。
无
