闫颖; 常乐; 姬慧敏; 宋诗; 肖瑛子; 卢卓群; 王露楠

doi:10.3760/cma.j.cn114452-20201120-00845

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新型冠状病毒核酸混采对检测结果的影响

中华检验医学杂志, 2021,44(5) : 388-393. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20201120-00845

摘要

目的

评估新型冠状病毒（2019-nCoV）样本混采对提取、扩增步骤的影响。

方法

取10只阴性咽拭子储存在6 ml病毒保存液中，充分混匀后1∶2、1∶10稀释，加入灭活2019-nCoV病毒培养液，以模拟10混1、5混1和单人份检测。使用a、b、c 3种提取方式和体系不同的核酸提取试剂及A~E 5种模板上样量和检测灵敏度不同的扩增试剂分别进行提取和扩增。

结果

对于相同的模拟混采样本，a提取的模板比b、c提取的模板检测循环阈值（Ct）分别提前2.10±0.47和3.46±0.62；扩增相同的混采核酸模板，A试剂的N基因Ct值比B试剂提前1.16±0.48，ORF1ab基因Ct提前2.36±0.54。扩增体系中加入10拭子核酸使A试剂检测Ct值滞后1.36±0.32，对B试剂无影响。使用a试剂提取，10混1混采后，C、D、E试剂的扩增Ct值比检测单拭子样本高1.66±0.39。对于400拷贝/ml的10混1样本，C、E试剂均可检出，D试剂的N基因漏检。

结论

混采引入的大量人基因组DNA干扰提取和扩增效率。在加大样本提取体积、提高提取试剂性能的同时，应选择大模板量上样、检测灵敏度高的扩增试剂，方可提高系统灵敏度和结果稳定性，大大降低漏检风险。

引用本文: 闫颖, 常乐, 姬慧敏, 等. 新型冠状病毒核酸混采对检测结果的影响 [J] . 中华检验医学杂志, 2021, 44(5) : 388-393. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20201120-00845.

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2019年12月至今，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球五大洲的200余个国家和地区大流行。截至2021年2月2日，新型冠状病毒（2019-nCoV）已造成全球1亿多人感染，223余万人死亡，对全球公共卫生造成严重威胁^［1］。

核酸检测是确诊疑似病例和无症状感染者的重要证据，在确定传染源、切断传播途径和保护易感人群方面发挥了重要作用。由于检测需求量大，为提升检测能力和效率，我国出台了“新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范”^［2］，并已在武汉、北京、瑞丽、青岛、喀什等城市使用混采检测策略进行了全员核酸筛查。美国、德国、印度等多个国家也施行了合并检测策略^{［3, 4］}。虽然混采可在低流行地区极大降低人力和经济成本，但这种策略对于检测结果的影响仍有待探讨。

为评估2019-nCoV样本混采对检测结果的影响，本研究使用灭活2019-nCoV病毒培养液和阴性咽拭子模拟混采样本，评估了混采对核酸提取、扩增步骤以及不同检测系统灵敏度的影响。

材料与方法

一、材料

1.灭活病毒培养液：2019-nCoV培养液（基因编号：MT135042.1）由中国军事医学科学院馈赠，该病毒培养液已经过65 ℃热灭活30 min处理，储存于-20 ℃。

2.试剂：本研究采用了a、b、c 3种核酸提取试剂以及A、B、C、D、E 5种2019-nCoV核酸检测试剂。提取试剂和核酸检测试剂的体系见表1和表2。

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表1

核酸提取试剂的基本信息

表1

核酸提取试剂的基本信息

试剂	提取方法	加样体积（μl）	洗脱体积（μl）	裂解时间（min）	洗涤时间（min）	洗脱时间（min）
a	磁珠法	400	100	30	4	10
b	手工柱提	140	80	10	4	2
c	磁珠法	200	100	6	2	2

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表2

2019-nCoV核酸检测试剂的基本信息

表2

2019-nCoV核酸检测试剂的基本信息

试剂	逆转录扩增方法	检测基因	内标	模板量（μl）	总体积（μl）	检测限（拷贝/ml）
A	一步法	N、ORF1ab	外源性	40	60	30
B	一步法	N、ORF1ab	RNaseP	5	25	500
C	一步法	N、ORF1ab、E	外源性	5	25	1 000
D	一步法	N、ORF1ab	RNaseP	5	25	500
E	一步法	N、ORF1ab	RNaseP	20	50	200

3.仪器：数字PCR仪器为QX200数字PCR仪（美国Bio-rad公司），核酸提取仪器为Pre-NAT Ⅱ自动核酸纯化仪（美国PerkinElmer公司）。扩增仪为ABI 7500（美国Thermofisher公司）、SLAN荧光定量PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司）。DNA浓度测定仪为Merinton微量分光光度计SMA6000（北京美林恒通仪器有限公司）。

二、方法

1.灭活病毒培养液定量检测：使用Pre-NATⅡ自动核酸纯化仪提取灭活病毒培养液原液。使用中国疾病预防控制中心发布的针对2019-nCoV基因组N和ORF1ab区域的引物和探针进行数字PCR。热循环条件如下：50 ℃ 60 min； 95 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s循环40次，58 ℃ 45 s，98 ℃ 10 min。

2.混采对提取影响的验证：在采集管中加入6 ml病毒保存液（virus transport medium，VTM）（图1）。取10份健康人的咽拭子样本，放入同一采集管中，充分震荡混匀，获得10混1样本管。再使用VTM将此管1∶2、1∶10稀释，获得5混1和单拭子的样本管。根据数字PCR定量结果将灭活2019-nCoV病毒培养液进行稀释，分别加入到3管咽拭子样本中，制备2019-nCoV终浓度为5 000、1 000拷贝/ml的不同拭子量的样本。使用a、b、c 3种提取试剂提取样本，并使用A、B 2种核酸检测试剂对提取产物进行扩增。比较不同试剂的提取效率，以及混采对提取效率的影响。每一样本从提取开始在同一批内进行3次重复。

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图1

样本制备示意图

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注：A为模拟混采样本制备，B为提取后混合模板制备；VTM为病毒保存液

图1

样本制备示意图

3.混采对扩增影响的验证：在采集管中加入6 ml VTM（图1），取10份健康人的咽拭子样本，放入同一采集管中，充分震荡混匀，作为阴性拭子样本。将灭活病毒培养液使用VTM稀释至终浓度为5 000和1 000拷贝/ml。使用a核酸提取试剂盒分别提取阴性拭子核酸和病毒核酸，洗脱体积减半。将提取后的阴性拭子核酸模板1∶2、1∶10稀释，再分别与病毒核酸等体积混合，获得拭子模板和病毒模板的混合物。使用模板上样量差异大的A、B两种核酸检测试剂盒进行扩增，以在不考虑混采对提取影响的情况下，比较混采样本中不同数量拭子的核酸对A、B试剂的扩增体系的影响。每一样本从提取开始在同一批内进行3次重复。

4.改进提取方法提高混采样本检测灵敏度的验证：根据图1A中步骤制备2019-nCoV终浓度为10 000、2 000和400拷贝/ml的10混1、5混1、2混1和单人份检测样本。使用a核酸提取试剂提取，C、D、E 3种2019-nCoV核酸检测试剂盒检测。每一样本从提取开始在同一批内进行2次重复。

三、统计学分析

采用Excel 2010进行数据处理，采用SPSS 20.0进行统计学分析。计量资料以 $\bar{x} \pm s$ 表示。多组间比较采用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、灭活2019-nCoV病毒的定量

数字PCR结果显示，2019-nCoV灭活病毒原液的浓度为2.9×10⁶拷贝/ml。后续样本均根据此结果配制。

二、混采对提取的影响

1.不同提取试剂的提取效率比较：使用a、b、c提取5 000和1 000拷贝数/ml的模拟混采样本，并用试剂A和试剂B扩增提取产物。试剂A、B的N和ORF1ab基因检测循环阈值（Ct）均为a提取组<b提取组<c提取组，a提取的模板较b、c提取的模板检测Ct值分别提前2.10±0.47和3.46±0.62。这一结果表明a试剂的提取效率高于b和c试剂。

2.混采对提取效率的影响：试剂A和试剂B在扩增a、b、c提取的模拟混采样本时，10拭子组的N和ORF1ab基因的检测Ct值均高于1拭子组（表3），1拭子、5拭子、10拭子3组间部分基因Ct值的升高差异有统计学意义（n=9，P<0.05），表明混采抑制了3种试剂对病毒核酸的提取效率。

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表3

A、B试剂扩增模拟混采样本的Ct值（ $\bar{x} \pm s$ ，n=9）

表3

A、B试剂扩增模拟混采样本的Ct值（ $\bar{x} \pm s$ ，n=9）

提取方法	拭子数量	5 000拷贝/ml					1 000拷贝/ml
提取方法	拭子数量	A试剂-N	A试剂- ORF1ab	B试剂-N	B试剂- ORF1ab	B试剂-RNaseP	A试剂-N	A试剂- ORF1ab	B试剂-N	B试剂- ORF1ab	B试剂- RNaseP
a提取	1拭子	29.82±0.03	29.85±0.23	31.23±0.07	31.99±0.09	34.14±0.21	32.70±0.15	32.34±0.17	33.95±0.21	34.47±0.27	33.60±0.07
	5拭子	30.70±0.20	30.17±0.07	31.75±0.09	32.61±0.12	31.62±0.07	33.12±0.29	32.66±0.31	33.87±0.38	34.86±0.56	31.39±0.05
	10拭子	30.74±0.10	30.55±0.35	31.85±0.07	32.63±0.07	30.96±0.26	33.64±0.14	32.91±0.35	34.32±0.33	34.82±0.45	30.30±0.15
H值		5.45	2.98	5.60	5.65	7.20	5.69	4.36	1.87	1.07	7.20
P值		0.06	0.26	0.05	0.05	0.004	0.03	0.13	0.44	0.66	0.004
b提取	1拭子	31.86±0.05	32.17±0.35	32.94±0.21	33.45±0.17	35.53±0.21	34.49±0.11	34.69±0.13	35.84±0.42	36.35±0.15	35.17±0.47
	5拭子	32.33±0.32	32.30±0.31	33.69±0.37	34.87±0.42	33.78±0.22	34.88±0.31	34.84±0.17	35.67±0.51	37.91±0.61	33.76±0.21
	10拭子	32.51±0.05	32.88±0.23	33.64±0.25	35.33±0.42	32.94±0.15	35.04±0.39	35.24±0.24	36.71±0.80	38.27±1.28	33.06±0.15
H值		5.60	5.60	5.42	6.49	7.20	3.32	5.06	1.69	5.42	7.20
P值		0.05	0.05	0.07	0.01	0.004	0.22	0.09	0.51	0.07	0.004
c提取	1拭子	32.94±0.17	32.58±0.52	33.77±0.13	35.32±0.17	35.02±0.14	35.74±0.51	35.21±0.19	37.90±1.56	38.87±1.60	35.43±0.19
	5拭子	33.68±0.12	33.94±0.55	34.36±0.66	36.45±0.38	32.71±0.19	36.22±0.33	36.60±0.79	37.40±1.86	38.68±1.10	33.09±0.17
	10拭子	34.02±0.49	34.17±0.70	34.31±0.44	36.17±0.76	32.02±0.23	36.86±0.51	36.89±0.41	39.02±1.38	39.49±0.36	33.14±0.21
H值		5.60	5.42	1.16	4.62	7.20	4.36	5.42	1.38	0.46	5.60
P值		0.05	0.07	0.63	0.10	0.004	0.13	0.07	0.57	0.87	0.05

注：检测结果为阴性时，Ct值按总循环数计算

在扩增相同的模板时，A试剂的N基因检测Ct值比B试剂提前1.16±0.48，ORF1ab基因Ct值提前2.36±0.54。总体来看，对于相同的样本，选取a试剂提取模板，并使用A试剂进行扩增，检测Ct值最低，系统性能最佳。

三、混采对扩增的影响

1.混采样本中人基因组DNA浓度的检测：在6 ml VTM中插入10个阴性拭子，使用a核酸提取试剂提取，上样体积为400 μl，洗脱体积为50 μl。DNA浓度测定表明，提取后的核酸浓度为105 mg/L，按照提取效率为100%计算，10混1的样本中人基因组DNA的浓度约为13 mg/L。

2. 混采样本中人基因组DNA对A、B试剂扩增结果的影响：使用a试剂提取阴性拭子核酸及病毒核酸，并用A、B试剂扩增拭子核酸与病毒核酸的混合模板。对于A试剂，在扩增含有相同浓度病毒核酸的模板时，N和ORF1ab基因的Ct值均随拭子核酸浓度的增加而增加，10拭子组的N和ORF1ab基因Ct值平均比单拭子组高1.36±0.32，1拭子组、5拭子组和10拭子组间比较，差异有统计学意义（n=9，P<0.01，表4）。B试剂的N和ORF1ab基因Ct值在1、5、10拭子组间差异无统计学意义（n=9，P>0.05）。这一结果表明，混采对A试剂影响较大，而对B试剂无影响。

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表4

A、B试剂扩增病毒核酸与不同浓度拭子核酸混合模板的Ct值分析（ $\bar{x} \pm s$ ，n=9）

表4

A、B试剂扩增病毒核酸与不同浓度拭子核酸混合模板的Ct值分析（ $\bar{x} \pm s$ ，n=9）

浓度(拷贝/ml)	拭子数量	A试剂-N	A试剂-ORF1ab	B试剂-N	B试剂-ORF1ab	B试剂-RNaseP
5 000	1拭子	29.43±0.06	29.95±0.08	30.56±0.10	32.63±0.21	34.03±0.35
	5拭子	29.72±0.03	30.55±0.07	30.63±0.20	32.70±0.18	31.32±0.19
	10拭子	30.36±0.08	31.56±0.48	31.00±0.38	32.79±0.11	30.29±0.10
H值		7.20	7.20	1.87	1.42	7.20
P值		0.004	0.004	0.44	0.54	0.004
1 000	1拭子	31.11±0.13	31.52±0.13	32.40±0.29	34.11±0.24	33.85±0.18
	5拭子	31.35±0.09	31.81±0.09	32.35±0.28	34.12±0.21	31.39±0.17
	10拭子	32.28±0.31	33.25±0.55	32.65±0.32	34.12±0.17	30.52±0.14
H值		6.49	7.26	0.09	0.09	7.26
P值		0.01	0.004	0.98	0.99	0.004

四、改进提取方法提高混采样本检测灵敏度的验证实验

1.混采对检测结果影响的验证：使用a试剂提取10 000、2 000、400拷贝/ml的模拟混采样本，并使用C、D、E 3种试剂扩增。对于同样浓度的病毒样本，D试剂和E试剂的RNaseP内参基因Ct值均随拭子数量增加而降低，且各拭子数量组间Ct值差异有统计学意义（n=8，P<0.01；表5），表明人基因组DNA浓度随着拭子数量增加而增加。与RNaseP变化趋势相反，各试剂的2019-nCoV N、ORF1ab和E区段检测Ct值均随拭子数量增加而增加，10拭子组的Ct值平均比单拭子组升高1.66±0.39，且部分拭子数量组Ct值间差异有统计学意义（n=8，P<0.05）。

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表5

C、D、E试剂扩增模拟混采样本的Ct值分析（ $\bar{x} \pm s$ ，n=8）

表5

C、D、E试剂扩增模拟混采样本的Ct值分析（ $\bar{x} \pm s$ ，n=8）

浓度(拷贝/ml)	拭子数量	C试剂-N	C试剂- ORF1ab	C试剂-E	D试剂-N	D试剂- ORF1ab	D试剂- RNaseP	E试剂-N	E试剂- ORF1ab	E试剂- RNaseP
10 000	1拭子	30.15±0.04	32.43±0.05	28.05±0.02	31.47±0.02	28.80±0.08	29.56±0.02	27.80±0.02	30.50±0.04	30.13±0.09
	2拭子	30.40±0.13	32.86±0.06	28.10±0.00	32.09±0.37	29.76±0.62	28.82±0.31	28.17±0.02	30.96±0.06	29.14±0.01
	5拭子	31.14±0.09	33.37±0.02	28.96±0.09	32.64±0.25	29.95±0.01	27.53±0.05	29.02±0.01	31.71±0.06	28.14±0.04
	10拭子	32.01±0.07	33.93±0.13	29.28±0.03	33.11±0.18	30.85±0.28	26.66±0.06	29.86±0.11	32.40±0.14	27.41±0.05
H值		6.67	6.67	6.75	6.17	6.00	6.67	6.67	6.67	6.67
P值		0.01	0.01	0.01	0.04	0.07	0.01	0.01	0.01	0.01
2 000	1拭子	31.28±0.08	33.60±0.15	29.17±0.01	32.87±0.00	30.21±0.18	29.57±0.12	29.15±0.07	31.94±0.09	30.04±0.04
	2拭子	32.39±0.23	34.42±0.24	30.04±0.16	33.46±0.07	31.14±0.04	28.83±0.00	29.80±0.01	32.56±0.04	29.45±0.06
	5拭子	32.47±0.09	34.64±0.23	30.40±0.32	34.36±0.08	32.01±0.07	27.66±0.01	30.51±0.10	33.25±0.04	28.16±0.06
	10拭子	33.16±0.48	35.32±0.22	30.43±0.22	34.10±0.15	32.14±0.15	26.73±0.03	31.08±0.16	33.70±0.19	27.39±0.14
H值		6.00	6.17	5.17	6.67	6.17	6.75	6.67	6.67	6.67
P值		0.07	0.04	0.16	0.01	0.04	0.01	0.01	0.01	0.01
400	1拭子	35.15±0.10	37.89±0.51	32.68±0.23	35.86±0.02	33.95±0.22	29.67±0.22	32.71±0.05	35.59±0.12	30.20±0.02
	2拭子	34.90±0.83	37.77±1.05	33.38±0.19	36.45±0.14	34.29±0.04	28.45±0.01	32.91±0.15	35.67±0.09	29.04±0.02
	5拭子	35.80±0.10	38.06±0.02	33.34±0.25	36.19±0.07	34.60±0.32	27.11±0.09	33.59±0.11	36.36±0.07	27.68±0.03
	10拭子	37.24±0.45	38.90±0.94	33.59±0.01	38.34±1.04	35.40±0.32	26.08±0.07	33.93±0.09	37.27±0.30	26.79±0.04
H值		5.17	0.50	4.93	6.17	6.17	6.67	6.45	6.17	6.67
P值		0.16	0.95	0.17	0.04	0.04	0.01	0.02	0.04	0.01

注：检测结果为阴性时，Ct值按总循环数计算

2.改进提取方法提高检测灵敏度的验证：在a试剂提取的条件下，对于400拷贝/ml的模拟10混1混采样本，C和E试剂均可检出，其中C试剂可检出样本浓度显著高于其试剂声称的1 000拷贝/ml的分析灵敏度。D试剂的ORF1ab基因可以检出400拷贝/ml，N基因出现漏检。

讨论

样本混合检测有两种方式，一种是将多人份的拭子样本采集在同一个采样管中，即混采模式，另一种是单人份采样，再将多份样本进行混合，即混检模式，二者的目的都是提升检测效率^{［5, 6, 7］}。混检由于多份样本混合，检测的分析灵敏度会随着混样样本数量的增加而降低，因此普遍认为混采模式是既可以保证灵敏度，又能提高检测效率的方式。本研究主要就混采模式对提取和扩增两个步骤的影响进行评价。

目前高通量的核酸提取均采用磁珠法，磁珠捕获核酸是非特异性的。混采引入的大量非病毒靶核酸与靶标核酸竞争结合磁珠，同时大量的细胞引入消耗裂解液中的胍盐和蛋白酶K，从而影响核酸提取效率。

影响核酸提取效率的关键因素包括上样量、模板洗脱体积、裂解时间、洗涤和洗脱时间。提取量的大小与初始病毒载量呈正相关^［8］，上样体积越大，洗脱模板体积适量可以有效保证获得足够的病毒核酸模板用以扩增，同时还可有效保证提取具有良好的重复性。a、b、c 3种提取试剂的上样体积/洗脱体积比分别为400/100、140/80和200/100，其中a试剂的上样体积高于b、c试剂，这是a试剂提取性能较好的重要原因。病毒裂解是让细胞和病毒包膜充分裂解释放核酸的步骤，作用时间短会导致病毒裂解不充分。洗涤步骤过快会造成洗涤不充分或洗涤液（一般为乙醇）不能挥发从而影响扩增效率。同样是磁珠法提取，a的样本裂解时间、洗涤和模板洗脱时间均长于c试剂，其提取的模板检测Ct值也比c提取提前3.46±0.62，说明样本裂解时间、洗涤和洗脱模板时间也是影响核酸提取效率的关键因素。磁珠法提取由于磁珠单分散、高比表面积，提取和纯化效率较高^{［9, 10］}。但是本研究中，在上样体积/洗脱体积相近的情况下，采取手工柱提法的b试剂的提取效率却高于采用磁珠法提取的c试剂，同样说明盲目的缩短裂解时间、洗涤时间和洗脱时间会大大降低提取效率。采用磁珠法操作过程中无需离心，非常适用于自动化、高通量的提取需求。在实际进行混采筛查时，使用大体积上样、提取效率高的磁珠法提取方法，可保证检测灵敏度，大大降低漏检风险。

大量非扩增靶标的核酸引入，如基因组DNA可能会影响引物和探针的结合效率，从而降低核酸检测的灵敏度。针对混采对扩增的影响，本研究选取了核酸模板加入体积差异较大的A和B试剂作为代表进行探究。A试剂说明书中验证了在待测血浆样本中加入2 mg/L人基因组DNA不影响检测效果。而10拭子混采时样本中的人基因组DNA浓度约为其验证浓度的7倍，对其检测结果的影响较大。两个试剂核酸模板上样量分别为40和5 μl，相差了8倍，A试剂Ct值随着混采拭子数增加而增加，受到了显著影响，但是由于A试剂同样有8倍体积的靶核酸模板上样，其对于10混1样本的检测Ct值依然低于B试剂检测同等病毒浓度的单拭子样本，提示其检测混采样本的灵敏度优于B试剂检测单拭子样本的灵敏度。目前获得国家药品监督管理局批准的试剂绝大多数为小体积核酸模板上样，因此混采对于扩增的影响较小。但是小体积模板上样试剂要达到较高的检测灵敏度，提取的效率至关重要。

本研究进一步采用本评估中提取效率最好的试剂，评估了3种不同分析灵敏度的试剂对混采模式的适用性。结果显示3个试剂检测10混1样本的检测Ct值平均比单拭子样本高1.66±0.39 Ct。由于所使用的提取扩增试剂和拭子样本的差异，不同文献报道十拭子混采检测比单拭子检测的Ct值高0.1~7 Ct不等^［7，11］。这些数据表明混采时，虽然没有直接对拭子样本进行稀释，但由于多拭子中大量人基因组DNA及其他干扰物质的影响，试剂整体检测性能下降。C试剂说明书中声明的分析灵敏度为1 000拷贝数/ml，在本研究中采用提取效率高的a试剂提取，10混采模式下400拷贝/ml样本可以检出。D试剂说明书中声明的分析灵敏度为500拷贝/ml，在5混1混采模式时，可以检出400拷贝/ml，10混1模式，N基因在400拷贝/ml浓度下出现漏检。E试剂说明书中声明的分析灵敏度为200拷贝/ml，该试剂是否在10混1的模式下可以达到试剂声称的灵敏度还需要进一步验证。此外，本研究根据灭活的2019-nCoV病毒培养原液的数字PCR定量结果制备混采样本，未对最终样本进行定量，因此稀释后的准确样本浓度仍需要进一步验证。

鼻、咽拭子的病毒核酸检出率与病毒感染进程密切相关，采样时机、采样的手势与采样的拭子材质对样本质量至关重要^［12］。单人份样本检测时，可通过RNaseP内标基因的Ct值从采样环节开始监测质量。10混1采样时，仅可通过RNaseP的Ct值监测混采样本的整体质量，或者在提取时加入外源性内标监测提取及扩增的质量，无法监测每一个样本的采样质量，因此可能更容易由于采样原因造成漏检。

本研究表明，在混采样本检测前应评估混采模式下的分析灵敏度，包括评估核酸提取方法的适宜性，多拭子的核酸模板对扩增反应的影响等。试剂的提取性能是开展混采模式的关键因素，使用加样量大、提取效率高的提取试剂，搭配检测灵敏度高的扩增试剂，方可保证混采样本的稳定检出，降低漏检风险。有条件的实验室可以使用模拟样本筛选适宜做混采检测的提取试剂和扩增试剂，作为大样本筛查的技术储备。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献

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贡献者信息

闫颖