研究伤口愈合过程中，细胞外基质（Extracelluar matrix, ECM）中粘附分子整合素β1的表达与胶原合成之间的密切关系。
运用间接免疫胶体金标记技术，在电镜下观察了12例中厚取皮供区创面成纤维细胞表面粘附分子β1整合素的表达及细胞超微结构的变化，并作了流式细胞仪检测。
中厚取皮供区创面成纤维细胞表面粘附分子整合素α5及β1亚单位的表达与对照组相比有显著差异；同时，前者细胞内富含有核糖体积聚的内质网，微管、微丝等细胞器的含量也较高。
上述结果揭示了在伤口愈合过程中，粘附分子整合素β1的表达与胶原合成之间有重要的关系，为进一步探索粘附分子在伤口愈合中的作用打下了基础。
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组织损伤后愈合过程中的一个重要病理特征是细胞外基质(Extracelluar matrix，ECM）的合成增加并在伤口周围聚集[1]。有关研究已表明成纤维细胞是合成和分泌ECM的主要细胞[2]。我们运用间接免疫胶体金标记透射电镜观察及流式细胞仪检测，研究了12例中厚取皮区创面成纤维细胞表面粘附分子β1整合素的表达及成纤维细胞超微结构的变化，以期对伤口愈合时粘附分子表达与成纤维细胞合成胶原蛋白间的关系有初步的认识。
需中厚植皮患者12例，供区创面12个，其中男性8例，女性4例；年龄6~40岁，平均年龄27岁，以同一病人正常皮肤为对照组。
细胞培养液（DMEM）、小牛血清购自Sigma公司，大鼠抗人整合素α5、β1亚单位单克隆抗体为美国加利福尼亚大学Caroline H. Damsky教授惠赠；胶体金标记兔抗大鼠单克隆抗体IgG为本校中心实验室惠赠。
中厚取皮后3~4天，供区严格无菌条件下常规活组织取材0.2cm×0.3cm，采用组织块法进行原代培养。将活检组织真皮部分剪成0.5mm ×0.5mm小块，贴附于培养瓶后加含20%小牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5% CO2孵箱。约2周后组织块周围有成纤维细胞贴壁生长，当细胞密度达到75%时，常规消化传代培养。取传代2~4代处于对数生长期的成纤维细胞为研究对象；取正常皮肤活检组织为对照组，成纤维细胞原代培养方法同上。
取处于对数生长期成纤维细胞1×106个，以pH 7.2的PBS洗涤2遍，2 000 r/min离心5 min后加入pH 7.2的PBS约1ml，分别加入10μl抗α5、抗β1单克隆抗体，置于4℃冰箱孵育1 h，期间每隔15min轻微振荡；以pH 7.2的PBS洗涤2遍，2 000r/min离心5 min备用。
取上述已标记了抗α5或抗β1单克隆抗体的成纤维细胞用等渗液洗涤后，以1.25%戊二醛微波固定5~20秒（微波炉型号为National NN 6850，800W2.45MHz)；固定后的标本以等渗液洗涤后加入1mlSPA-胶体金，35℃水浴中振荡1 h，pH 7.2的PBS冲洗2遍，再以2%戊二醛固定45 min，然后加血浆凝成块，按常规电镜标本超薄切片，染色后以透射电镜观察，持续计数20个细胞，观察成纤维细胞表面结合的胶体金颗粒。
将上述标记了抗α5或抗β1单克隆抗体的成纤维细胞用pH7.2的PBS配成1ml，按上述单克隆抗体标记方法加入10µl单克隆抗体IgG, 4℃孵育40min，然后加含免疫荧光的二抗（小鼠抗大鼠），行流式细胞仪检测。
2.1 12例患者行中厚取皮术后3~4天供区成纤维细胞表面有大量与α5、β1亚基结合的胶体金颗粒附着并聚集成簇，而对照组正常皮肤真皮层成纤维细胞表面仅见零星的胶体金颗粒（图1，图2)，经连续计数20个细胞表面的胶体金颗粒，两者差异有非常显著意义（P<0.01，表1）。
两组成纤维细胞表面附着胶体金颗粒的比较（
±s）
Comparasion of amounts of colloidal golds clustered on the surfaces of fibroblasts from two groups （
±s）
两组成纤维细胞表面附着胶体金颗粒的比较（±s）
Comparasion of amounts of colloidal golds clustered on the surfaces of fibroblasts from two groups （±s）
| 组别 | α5 | β1 |
|---|---|---|
| 实验组 | 30.960±6.661 | 20.220±4.067 |
| 对照组 | 4.738±1.417 | 2.667±1.188 |
| t值 | 14.950 | 14.420 |
| P值 | <0.01 | <0.01 |
2.2 实验组成纤维细胞胞浆内细胞器丰富，尤其是一些与蛋白代谢、胶原合成有关的细胞器如内质网、高尔基氏体丰富，表面附着大量核糖体，并见成束的微管、微丝；对照组正常皮肤真皮成纤维细胞内质网、高尔基氏体未见增多，仅见散在的微管、微丝（图3，图4）。
2.3 流式细胞仪检测结果表明实验组成纤维细胞表面整合素α5、β1的表达率分别为76.68%和36.59%，均高于正常皮肤成纤维细胞表面整合素α5（4.54%）、β1（4.51%）的表达率，两者差异有非常显著意义（P<0.01)。
3.1 伤口愈合中部分成纤维细胞表达Ⅰ、Ⅲ前胶原mRNA增多[3]，初步证明了创面愈合过程中存在着高产量胶原的成纤维细胞异常亚群，这种高产量胶原亚群的激活机制受多方面因素的调控。随着分子生物学技术的日益发展，人们逐渐认识到ECM-成纤维细胞间的作用在纤维化过程中的意义。ECM不仅构成器官和组织结构的框架，还直接与多种细胞（如成纤维细胞、血管内皮细胞、角朊细胞、单核细胞等）的迁移、趋化、增殖和分化有关。整合素亚族是介导成纤维细胞与ECM作用的最主要的粘附分子，细胞粘附分子与ECM结合后的生物学效应主要表现为直接诱导成纤维细胞的移行和增殖；或者间接激发其他免疫活性细胞及由此引起的细胞变形与运动，从而产生更多的胶原蛋白、血管生成因子或成纤维细胞生长因子，刺激毛细血管生长，加速伤口愈合[4]。
3.2 β1整合素由α5、β1两个亚基组成。我们运用免疫电镜技术和流式细胞仪技术检测到伤口愈合时成纤维细胞表面整合素亚基较正常皮肤真皮成纤维细胞的表达增多，至少表明成纤维细胞表面粘附分子的高表达对组织损伤后伤口愈合有一定的促进作用。
3.3 有文献报道ECM与整合素结合后可能发生粘附分子在细胞表面成簇、肌动蛋白合成及表达的变化[5]。我们观察到伤口愈合时成纤维细胞胞浆内有密集成束的微管、微丝，内质网丰富，表面附有大量的核糖体颗粒；而正常皮肤成纤维细胞内很少观察到或偶见零星的微管、微丝，内质网及核糖体的排列分布正常。这些现象提示伤口愈合时真皮成纤维细胞蛋白合成旺盛，推测粘附分子整合素α5、β1亚基的成簇与胞浆内密集的微管、微丝间存在着一定的关联性；继而与伤口愈合时成纤维细胞胶原蛋白的合成有关。
3.4 Dhawn等的研究表明粘附状态下小鼠NIH3T3成纤维细胞胶原基因表达较细胞悬浮状态时明显增加，提出粘附分子表达可随ECM-细胞间相互作用的变化而自我调控[6]。本实验初步提示了与Dhawn相同的研究结果。粘附分子整合素α5、β1亚基与伤口愈合时成纤维细胞胶原蛋白合成间是否存在直接的调控以及调控的具体形式，我们将作进一步的研究。
