近年来黑色素瘤发病率逐年增高，且恶性程度高、转移发生早，很多患者就诊时已经发生远处转移，无法通过手术完全切除。循环黑素瘤细胞是由原发或转移病灶进入血液循环的黑色素瘤细胞，在肿瘤的复发和转移中发挥了重要作用。研究表明，借助循环黑素瘤细胞的液体活检技术可以做出早期诊断、进行临床分期及判断患者预后，且可重复操作而用于治疗效果的评估，因此受到广泛关注。该文就循环黑素瘤细胞的检测及相关作用等方面进行了综述。
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近年来黑色素瘤发病率逐年增高，且因恶性程度高、转移发生早，死亡率在皮肤恶性肿瘤中排名第一而引起重视。循环黑素瘤细胞(circulating melanoma cell，CMC)是存在于外周血中的恶性肿瘤细胞，被认为是原发灶与转移灶之间的桥梁，即肿瘤转移复发的具体实施者，并可以通过检测CMC对患者进行早期诊断、临床分期、判断预后。本文就CMC的概念、检测及临床应用等方面进行介绍。
黑色素瘤(malignant melanoma，MM)，是来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，常见于皮肤，亦可见于黏膜、眼脉络膜等。近年来发病率呈逐渐上升趋势，平均每年增加2.6%，仅美国每年就有7万左右的新发病例[1]；而我国虽然发病率较低，但近年也呈倍数增长，每年超过2万的新发病例[2]。其死亡率在皮肤恶性肿瘤中排名第一，因而引起了世界范围的广泛关注。
病理检查可确诊黑色素瘤，早期诊断和早期治疗可使90%的患者得到根治[3]。然而，黑色素瘤恶性程度高，远处转移早，很多患者就诊时已经发生淋巴结或远处转移，无法通过手术切除达到治愈目的。转移性黑色素瘤的治疗方法依次经历了放化疗、免疫治疗和分子靶向治疗3个阶段，然而黑色素瘤对放化疗不敏感、免疫治疗不具普遍适用性[4]、靶向治疗易产生药物耐受[5]，理想的治疗手段仍未出现，死亡率占据了皮肤相关肿瘤的80%[6]。寻找更合适的早期诊断及治疗方式已经成为整形外科领域亟待解决的问题。
早在100多年前，Ashworth等就在乳腺癌患者尸检的血液中发现了类似于肿瘤的细胞，称之为循环肿瘤细胞(circulating tumour cell，CTC)，是存在于外周血中的恶性肿瘤细胞，由原发病灶产生并进入血液循环到达身体的指定部位[7,8]，能够反映原发肿瘤的特性，因而成为肿瘤领域的研究热点。在黑色素瘤患者中，我们将血液中检测到的肿瘤细胞称为CMC。
黑色素瘤发生远处转移时，肿瘤细胞由上皮细胞向间质干细胞转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[9]，部分肿瘤细胞失去上皮细胞的黏附特性而获得间质细胞和干细胞的特性，具有更强的转移和侵袭能力，也因此表现出明显的异质性[10]。每天有400万左右的原发肿瘤细胞进入血液循环，机械杀伤和免疫识别等使绝大多数肿瘤细胞发生坏死或凋亡，只有极个别与机体内环境相适应的细胞能够存活下来[11,12]，因此血液中含有的CMC非常少，大约每50亿个外周血细胞中才会有1～3个[7]。这些存活下来的肿瘤细胞通过细胞间黏附分子-1受体和整合素-β2的相互作用，使中性粒细胞和黑素瘤细胞形成复合物，与内皮细胞发生相互作用，最终使得肿瘤细胞渗出血管，侵入周围组织而发生远处转移[13]。可见CMC为原发灶与转移灶之间的桥梁，即肿瘤转移复发的具体实施者。
CMC进入血液循环时经历了EMT转换，而表现出明显异质性。此外，血液中含有的CMC极少，且部分包被在血小板形成的循环肿瘤微栓中而无法被识别，很难通过传统的方法进行检测。因此研究之前，一般先根据CMC形态学或者表面标记对外周血样本进行分离，以达到富集的效果，再对其进行检测。
由于外周血CMC具有黑色素瘤细胞和间质干细胞的双重特性，其较为常见的表面标志物主要有黑色素瘤特异性标记物和干细胞样标记物2种。
①黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，即高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)，可通过细胞骨架重排使色素瘤侵袭增加，并调节整合素介导的细胞迁移过程[14]。Kitago等[15]发现85%以上的CMC细胞表面可表达特异性抗原HMW-MAA，而健康人外周血中并未发现，其是目前最常用的标记位点。②黑色素瘤细胞黏附分子(MCAM)，研究发现超过70%的转移性黑素瘤患者CMC表面可表达MCAM，并且表达含量与肿瘤的浸润深度、远处转移相关[16]。③S-100能反应黑色素瘤进展及临床分期，其表达与预后明显相关[17]，敏感性较高。④HMB45在表皮黑色素瘤细胞中呈强阳性，而在其他组织黑色素瘤细胞中表达较少，特异性比S-100高。⑤Vimentin在侵袭性黑色素瘤细胞中呈高度表达，与恶性程度及预后明显相关，其过表达与血源性转移相关，可作为血源性转移的指标[18]。
循环黑素瘤细胞在EMT的过程中获得部分干细胞的特征，因而携带类似干细胞的基因序列、蛋白表达和表面标志物，如ATP-结合盒亚科B成员5(ABCB5)、巢蛋白(NES)、RANK、CD133和CD271等[19,20,21]，研究认为这些干细胞样标志物与肿瘤细胞转移和侵袭性增加密切相关，因而也可应用于患者外周血中CMC的检测。当然CMC表面标记还包括MelanA、MAGEA3、MITF、PNL-2、酪氨酸酶等。
研究表明，早期患者CMC检测主要表现为单一标志物阳性，而晚期患者由于CMC基数增大或异质性增加，检测时可发现多个标记物阳性。Freeman [19]等利用黑色素瘤特异性表面标记物MCSP、MCAM，及黑色素瘤干细胞样标记物ABCB5、CD271标记CMC，发现联合标记比单一标记具有更高的检出率。
循环黑素瘤细胞的分离富集通常依据其物理或免疫学特性，主要包括滤过法、密度梯度离心法、免疫磁珠法(包括阴性、阳性富集)等。
根据循环黑素瘤细胞比外周血细胞体积大且硬度高的特点，将外周血样本通过滤过膜过滤，CMC由于直径大于孔径而被留滞在滤过膜上，该法成本低、费时少，还可以维持细胞的活性和完整性。当与检测技术结合使用时，ISET可将1 ml血液中渗入的1个CMC分离出来[22,23]。但形态学分析显示CMC的大小和形态差异较大，小于8 μm的会被滤过掉而无法捕获，降低了分离效率[24]。
利用特殊分离液将密度不同的细胞区分在相应区域，CMC主要存留于密度类似的单核细胞富集层。该法操作简单，能够保持细胞完整性，可使RT-PCR的检测灵敏度增高，提高RNA富集效率并减少背景干扰[25]，但由于得到的CMC和大量密度相似的单核细胞混在一起，降低了检测效率。
目前CMC检测技术大致可分为两类，一类为核酸检测法，主要包括各类聚合酶链式反应；另一类以细胞计数为主，包括免疫细胞化学技术、免疫原位杂交等。
研究发现43%～66%的黑色素瘤患者携带BRAF基因型突变，近来又从ctDNA中检测到NRAS、PIK3CA等突变基因型[29]。RT-PCR技术就是针对这类基因突变进行特异性检测，从而发现外周血中的CMC，敏感性较高，可在106个外周血细胞中检出CMC，但容易出现假阳性，且适用范围有限。近几年来有学者又研发出多种改进的PCR技术用于检测基因序列的改变，如实时荧光定量PCR(qRT-PCR)[30]、竞争性等位基因特异性荧光探针PCR(castPCR)、微滴数字PCR(ddPCR)等。Ashida等[31]发现castPCR可在血浆BRAF无细胞DNA(cfDNA)中检测出浓度为0.5%的BRAFV600E ctDNA，而Reid等[32]发现ddPCR允许将BRAF-V600E/K的突变频率检测提高到0.000 5%。
利用标记的抗体或抗原对CMC进行定性、定位或定量检测，经过特定的化学染色反应后，用显微镜或电子显微镜进行观察。该法的切片可进行细胞大小和形态学分析，但由于理想的检测技术应能从2.5×108个外周血细胞中检出单个CMC，而每张玻片能检测的细胞量为105～106个，因而检出效率较低，难以广泛应用于临床[33]。近年来该技术不断改进，又陆续研发了光纤阵列扫描术[34]、激光扫描细胞仪[35]等，能够快速扫描并定位免疫荧光标记的CMC细胞，从而提高检测的敏感性。
依据特异性抗原对CMC进行染色，借助于流式细胞仪进行多参数、快速地定量分析，同时可检测细胞内DNA含量和特异性表面标记物。近来He等[36]研发了双波长光声流式细胞术联合纳秒脉冲黑素瘤特异性激光，不仅可以使CMC实现无标记成像，还可通过光声信号发出的精准激光杀死CMC，达到协助早期治疗的目的。
将蛋白水平的免疫荧光染色技术与基因水平的FISH技术相结合，再用特异基因探针鉴别CMC，不依赖CMC表面标志物，因而检测效率较高。
借助集成式微流控系统，将捕获到的CMC隔离在相互独立的微孔芯片中，进一步对其分子、基因水平分析。然而，芯片通道容易堵塞、制作芯片价格昂贵等问题限制了其在临床上的广泛使用。Cellsearch系统是目前自动化程度最高的检测技术，将免疫磁珠富集和免疫组化相结合，富集的同时还可对细胞进行拍照、分析、计数。由于创伤小、可重复、高特异性、高灵敏性等优点，是目前美国药品与食物监督管理局(FDA)批准的唯一一种用于分离检测CTC的方法，在临床上已有报道应用于检测CMC[37]。
CMC作为原发和转移灶之间的桥梁，包含了大量的生物学信息，其临床应用如下：①CMC来自原发或转移病灶，保留其生物学特性的同时又带有明显异质性，因此通过对二者进行比较可以了解肿瘤转移复发的动态机制，并以此研发黑色素瘤的靶向治疗药物，如vemurafenib已被公认为携带BRAF V600E突变的黑色素瘤患者的一、二线化疗用药。②肿瘤早期筛查及临床分期。早期黑色素瘤在微小病灶未能切取或影像学检查未能发现时，已经可以在外周血中检测到CMC，可以此进行诊断及并根据数量进行临床分期。Proebstle等[38]对212例黑色素瘤患者进行外周血检测，发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者检出率分别为12/106(11.3%)、10/56(17.9%)、8/26(30.8%)、16/24(66.7%)，可以看出不同临床分期患者的血液中都可能含有CMC，且晚期相对于早期患者阳性率更高。③疗效监测。动态监测黑色素瘤患者血液中CMC数量的变化，可以快速评估药物的治疗效果，从而制定更为合理的个体化治疗方案[19]。④判断患者预后。目前临床研究已经证实血液中检测到的CMC与黑色素瘤患者的预后相关，并可将其作为独立的预后因素。Khoja等[39]对101例晚期黑色素瘤患者外周血进行检测，发现CMC ≥ 2个的患者较CMC<2个的患者具有更短的总生存率。
黑色素瘤是第1个可在外周血中检测到肿瘤细胞的实体肿瘤，时至今日已有大量证据表明，检测外周血CMC对于发现早期及微转移病灶、指导临床治疗、监测疗效都有非常显著的意义。然而CMC检测技术由于一些原因在临床上的应用还不够成熟。首先，CMC具有明显异质性，每个肿瘤细胞在经历EMT转换时可能发生的方向及程度都不尽相同，很难通过单一的标志物进行全面检测，目前比较倾向于寻找更为特异或最佳的标志物组合，兼顾特异性的同时，提其高敏感性。其次，外周血中CMC含量极少，且部分CMC包被在血小板形成的循环肿瘤微栓中而无法被识别，如何在大量血细胞中更有效地检测出微量目标细胞，是一个较为棘手的问题。当然，目前对CMC的研究大多停留在计数层面上，而数量能够带来的信息毕竟是有限的，我们必须深入到分子水平，研究CMC的蛋白质组学或基因组学信息，充分利用外周血中每一个CMC所能提供的信息。同时，液体活检技术不仅仅只涉及CMC，也包括了血液中游离的ctDNA、外泌体DNA及RNA，以及血清相关肿瘤蛋白等，这些生物大分子都能提供大量肿瘤原发或转移病灶的信息，而现在对这一领域的研究还少之又少，更有待于进一步地探索。充分利用好液体活检技术，必将推动个体化精准医疗的发展。
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