小耳畸形的发生发展是多因素、多机制共同作用的结果，可能与遗传因素、生活环境及方式等因素密切相关，而遗传学则是其病因学的核心。该文从表观遗传学、基因多态性、染色体改变、基因水平改变、信号通路等方面，对小耳畸形遗传学方面的研究进行了综述，对其病因进行了探讨和总结。
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先天性小耳畸形是由胚胎时期第一鳃沟及其附近第一、二鳃弓发育异常引起，常表现为耳廓畸形、外耳道闭锁和(或)中耳畸形，并伴有不同程度听力损害[1]。其伴发畸形常涉及多个部位，如先天性心脏病、并指/趾、脊柱裂、尿道下裂、小头畸形、唇腭裂、肾脏发育不全和肛门闭锁等[2]。先天性小耳畸形发病率为(0.83～17.40)/万[1]，我国约为3.06/万[3]。目前，由于单基因缺陷或染色体畸变等，已报道了超过18种与小耳畸形相关的综合征，常见的有眼-耳-脊椎综合征、Treacher Collins综合征等[1]。因此，遗传因素在先天性小耳畸形中发挥着重要作用。了解小耳畸形的遗传特点，探讨其发病机制，预防畸形发生成为亟待解决的问题。我们对先天性小耳畸形遗传学方面的研究进展作一综述。
目前认为先天性小耳畸形的发生除遗传因素外，常见的还包括环境因素、种族差异、父母基本状况、母亲孕期暴露情况及药物使用等。
研究表明，母亲受教育程度低，居住于发展水平较低的地区或重工业地区，高龄妊娠、糖尿病、高血压、自然流产及多产史、孕期前3个月感冒史、患急性感染性疾病、孕激素使用、接种风疹疫苗、吸烟饮酒等，与先天性小耳畸形的发生有关，同时，孕早期摄入足够量的叶酸可降低患小耳畸形的风险[4,5,6,7]。女性妊娠期暴露于各种致畸因素也与小耳畸形的发生关系密切，包括免疫抑制剂类，如环磷酰胺、霉酚酸酯等[8]；杀虫剂类，如二氯苯氧基酸/酯、新烟碱类[9]；治疗慢性疾病的药物，如异维甲酸等[10]。
父亲吸烟、酗酒史及职业环境中重金属暴露等与小耳畸形的发生有关[5]。
先天性小耳畸形病因目前尚不明确，在传统的遗传、环境因素等研究基础上，表观遗传学为其病因学研究提供了新思路。表观遗传学是研究没有发生DNA序列变化，但基因表达出现了可遗传改变的一门生物学分支，主要调节机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及非编码RNA调控等[12]。
DNA甲基化是指DNA甲基化转移酶将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基催化转移到胞嘧啶和尿嘧啶(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中第5位碳原子上，CpG相对集中的区域称为CpG岛。DNA甲基化容易受激素、饮食、药物等外界因素的可逆修饰，而基因转录水平与其甲基化水平呈负相关[13]。
宋宇鹏等[14,15]对先天性小耳畸形残耳软骨及正常耳软骨的全基因组甲基化水平差异进行筛查，初步建立了先天性小耳畸形甲基化谱，发现COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3基因甲基化水平差异可能与小耳畸形发病有关，并进一步验证了COL18A1_2_CpG_17位点的甲基化水平差异具有统计学意义，而COL18A1基因的低甲基化可能会导致转录和翻译过程的异常开放，或其编码的蛋白引起组蛋白修饰或非编码RNA调控，通过协同作用对发育过程形成干扰。刘嘉锋等[16]、韩娟等[17]发现FGF3和EYA1基因启动子区域存在低甲基化状态，且每个位点的甲基化程度不均一，可能是在抑制基因转录方面作用不同所致。
非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的功能性RNA分子，常见的具有调控作用的非编码RNA包括siRNA、miRNA、piRNA以及长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)[18]。(1)miRNA干扰：miRNAs是一类只有20～24个核苷酸的非编码RNA，主要通过与靶mRNA的3′UTR区域的互补结合抑制翻译水平的基因表达，参与调节细胞的生长、分化和凋亡[19]。宋宇鹏等[20]对先天性小耳畸形患者残耳软骨及健侧耳软骨进行全基因组筛查，得到12个存在显著差异的miRNAs和mRNAs，包括miR-148b-5p、miR-181a-3p、miR-221/222-3p、miR-301a-3p、miR-320c、MMP13、CAST、MML、PDE5A、OTUD4、TGOLN2，它们之间构成调控网络，但机制尚未明确。Li等[21]、Wei[22]发现在残耳软骨中miR-486-5p、miR-200c、miR-451、miR-203的表达存在显著差异。miR-200c可下调靶基因TRPS1，后者是一种转录抑制因子，可与GATA序列特异结合，在脊椎动物发育的特定位点和阶段抑制GATA调控基因的表达，调控软骨细胞增殖、分化，而耳廓软骨发育正是小耳畸形最突出、最多样化的特征。miR-200c和miR-451可上调靶基因OSR1，后者是一种转录因子，在早期胚胎形成过程中表达于中胚层，并在肢体及鳃弓发育过程中动态表达。miR-203调控了一系列靶基因和lncRNA，包括细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)、转移相关肺腺癌转录本1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)。SOCS3是胰岛素样生长因子1信号转导的功能抑制剂，可导致软骨细胞蛋白多糖合成减少，导致软骨降解。LncRNA MALAT1可促进细胞增殖和转移。miR-200c和miR-451可受信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)1/STAT2转录因子的调控，而STAT信号通路的激活可导致软骨细胞分化的改变。(2)lncRNA调控：lncRNA是指长度超过200个碱基，没有蛋白质编码能力的RNA分子。与编码蛋白质的mRNA相比，lncRNA的丰度较低，通常位于细胞核内，组织特异性更强，且物种间序列保守性较差，在基因表达调控和表观遗传修饰中具有重要作用[23]。Wei[22]对小耳畸形患者数据进行miRNA生物信息学分析时，发现lncRNA MALAT1与miRNA形成调节网络，可能在外耳发育中起重要作用。张玲等[24,25]发现在残耳软骨中lncRNA表达具有明显的差异，进一步研究发现lncRNA-NR_028308在同一患者残耳软骨中的表达明显高于其正常耳廓软骨组织中的含量，其相对应的基因BRE有抑制细胞生长的作用，但机制尚不明确。
亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，其某些位点的突变可引起酶活性降低及热稳定性改变，妨碍叶酸代谢途径，导致疾病产生。MTHFR多态性与许多先天性异常相关，如神经管缺陷、器官和身体结构缺陷及先天性心脏病等，与MTHFR有关的2种最常见的多态性是C677T(rs 1801133)和A1298C(rs 1801131)[26]。研究发现MTHFR基因677C-T基因多态性与男性先天性小耳畸形的遗传易感性有关，其携带的T等位基因可使高度保守的丙氨酸转为缬氨酸，降低MTHFR的活性及热稳定性，影响叶酸代谢[27]。胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TYMS)也是催化叶酸代谢途径中dUMP转化为dTMP的关键酶，在TYMS rs2790基因多态性中，携带G等位基因可显著增加男性小耳畸形发病风险[28]。
部分先天性小耳畸形患者存在染色体畸形，主要包括染色体重排、微缺失、三体综合征等。如三倍体18、21、22，三倍体13和18的嵌合体，以及染色体4p、5p、18p、18q和22q13的缺失[29,30]。Davies等[31]发现染色体6p24及9p23部分区域易位与唇腭裂及双侧小耳畸形有关。Venditti等[32]发现20号染色体的复杂重排可能与先天性小耳/无耳畸形综合征相关。Li等[33]对一个单纯性双侧小耳畸形家系进行全基因组连锁分析后，在染色体4p15.3-4p16.2上发现了提示性的连锁位点，并鉴定出了9个与发育相关的基因，包括EVC、EVC2、HMX1、HTRA3、NKX3-2、CC2D2A、CRMP1、DRD5和SLC2A9。
Hox是一种同源异型盒基因，在进化过程中编码高度保守的转录因子，在整个发育过程中控制细胞的位置识别和形态发育，并启动其他基因级联反应。Hox基因在染色体上按照发育过程中的表达顺序排列，且在机体不同部位的表达存在差异[1]。在脊椎动物颅面发育过程中，颅神经嵴细胞(cranial neural crest cell，CNCCs)在构成发育头部的软骨、骨骼和结缔组织中起重要作用，而Hox基因可调节胚胎时期第二鳃弓NCCs的前后体轴，其表达异常或缺失可能会造成表型的改变[34]。Hoxa1基因失活的小鼠表现为外耳发育不全，中耳和内耳发育异常，Hoxa1/Hoxb1复合突变体表现为无耳畸形，Hoxb6和Hoxa7基因缺陷小鼠除了有开放眼裂和腭裂外，还伴有小耳畸形[1]。Hoxa1基因纯合突变的猪动物模型符合人类双侧小耳畸形特征[35]。以往研究发现Hoxa2是第二腮弓内唯一表达的Hox基因，是构成耳廓形态发生的基本转录调节因子[34]，在人类中，HOXA2部分功能丧失可导致双侧小耳畸形，在小鼠中，Hoxa2在妊娠早期失活会导致重复外耳道和耳廓缺失，而其晚期失活则会导致耳廓萎缩，与人类HOXA2基因突变情况相似。Minoux等[36]发现小鼠耳廓源于第二鳃弓内表达Hoxa2的神经嵴衍生的间充质。同时，参与人类耳廓发育异常的众多基因是HOXA2基因的靶点，如Hoxa2通过骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)信号通路和Eya1的表达部分控制了耳廓的形态发生。
Six是另一种同源异型盒基因，在脊椎动物的SIX结构域中有SIX1～6六个成员，均参与外耳发育[37]。实验证实，Six2基因是Hoxa2、Hox11的下游基因，Hoxa2可抑制Six2的表达，Hox11缺失可致Six2表达降低。在小鼠中，Six1/Six4复合突变体表现为小耳畸形，而Six1基因单独缺失者却表现为正常的外耳和中耳，表明SIX基因家族在进化过程中存在功能冗余性，即某个基因缺失后并不影响其他基因表型[38]。
EYA和SIX基因通过形成转录复合体发挥调控作用。其中，EYA1和SIX1在生长基板中表达，包括耳基板及发育中的肾，对感觉器官发育至关重要的基因的表达具有调节作用，其功能丧失会导致胎盘缺陷、基因表达谱改变、细胞凋亡、胎盘细胞增殖减少等[39]。Eya1编码蛋白质对鳃弓及耳部发育至关重要，且其具有基因剂量效应，需达到一定阈值才发挥效应，这种阈值效应可以解释不同患者之间的表型差异，即使在同一家系中也存在外显不全和表型变异[40]。敲除Eya1基因的小鼠表现为无耳畸形，表明其在耳廓软骨的构型方面起重要作用[41]。同时SIX1、SIX5和EYA1与鳃-耳-肾及鳃-耳综合征有关[34]，但林琳等[42]对100例中国先天性小耳畸形伴耳前凹、耳前赘患者行基因突变检测，未发现EYA1和SIX1基因已知的热点突变，结果均表现为单核苷酸多态性。
TBX1是转录因子T-box基因家族成员，在鳃弓的中胚层和外胚层表达，引导来源于不同部位的NCCs细胞束正确分离并进入各鳃弓[34]。在小鼠中，Tbx1突变可导致外耳和中耳发育缺陷及内耳感觉器官发育不全。其在鳃弓内胚层表达失活后，也出现了类似的表型，表明Tbx1在鳃弓形态的发生上起主要作用[43]。TBX1还与人类DiGeorge综合征密切相关，后者是最常见的染色体微缺失疾病之一，表现为耳部缺陷、听力障碍、颅面异常等，染色体分析发现在22号染色体末端有3 Mb片段的缺失，包含约30个基因，其中包括TBX1[44]。
Pact基因在小鼠发育早期源于第一鳃弓，在前颅底的组织中表达，其对耳、下颌骨等颅面部骨骼的正常发育至关重要。其编码的Pact是一种很强的dsRNA结合蛋白，也可激活蛋白激酶Pkr发挥效应。Rowe等[45]发现，Pact－/－小鼠表现为明显的外耳畸形、外耳道狭窄或闭锁、听小骨畸形及传导性听力障碍，而Pact＋/－小鼠耳畸形程度较Pact－/－轻。原位杂交实验显示，Pact mRNA在野生型胚胎中及成年小鼠耳朵的外、中、内耳3个部分均有表达。此外，因为Pkr－/－小鼠完全不具有小耳畸形的特征，Rowe推测Pact的功能可能不是由Pkr激活介导，而是与dsRNA结合有关。而潘博等[46]对我国221例先天性小耳畸形患者进行PACT基因突变检测，除1例散发患者PACT基因外显子4出现无义突变，其余未见PACT基因突变。
外耳发育的信号通路调节多与CNCCs相关，后者是一种多能干细胞，是第一、二鳃弓间充质的主要成分，具有迁移性。只有携带耳廓各个部分正常发育信息的CNCCs在正确的时间内迁移入正确的区域，耳廓才能正常形成，一旦其迁移的路径、时间或区域受到干扰，则会形成畸形耳廓[34]。而基因和各转录因子可通过某些信号通路参与并调节CNCCs的迁移和发育，目前已知参与外耳发育的信号通路包括BMPs通路、Wnts通路、成纤维细胞生长因子通路(fibroblast growth factors，FGFs)、内皮素通路、维甲酸通路、Shh通路等。这些信号通路的失调是导致发育不良的潜在因素。
BMP基因中，BMP5被认为是人类先天性小耳畸形的致病基因。其转录产物在正常骨骼发育的最早阶段表达，是启动骨骼凝聚区形成的关键信号，可诱导间充质细胞凝聚及未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化。在小鼠中，Bmp5与促进外耳生长的关系明显强于外耳的早期分化和形成。Bmp5基因突变的小鼠通常表现为短耳畸形，可能与耳软骨支架缺陷有关[49]。张娇等[50]对35例先天性小耳畸形患者BMP5成熟肽基因进行突变检测，发现了1种错义突变：第213位点发生TTTT-ACAC突变，编码氨基酸由苯丙氨酸→组氨酸，由于该突变位于BMP5功能蛋白的成熟肽区，可能影响了BMP5功能蛋白的功能，故此突变为致病突变。
FGF可影响细胞的增殖、分化、迁移和存活，其参与指导NCCs成为外胚间充质细胞，并通过诱发Dlx2和Barx1表达，调控NCCs前后轴和远近轴模式[51]。FGF信号通路涉及不同的配体和受体，尤其是Fgfr1～3在耳廓发育过程中发挥不同的作用。动物实验表明，FGF是NCCs的关键成活因子。斑马鱼中，Fgf3表达水平下调可导致第三、四鳃弓内NCCs凋亡[52]。小鼠中，Fgf8在第一鳃弓内缺失同样导致NCCs大量凋亡，且Fgf8基因突变小鼠表现为外耳发育不全或完全缺失[53]。后脑表达的Fgf3和间充质内表达的Fgf10可直接激活其外胚层的高亲和受体Fgfr2b，以旁分泌方式诱导耳发育[54]。
内皮素通路在调节NCCs的增殖和迁移方面具有重要作用。内皮素-1(endothelin-1，ET-1)由血管内皮细胞分泌，具有血管收缩活性，在鳃弓区域，其编码的蛋白质与表达内皮素-1受体A型(endothelin receptor type-A，Ednra)的NCCs结合后，激活核内相关基因，形成ET-1/Ednra-Dlx5/Dlx6-Hand2信号通路，保证了下颌突来源的相关结构正常发育。内皮素或内皮素受体突变的小鼠表现为各种耳畸形，如ET-1基因缺陷的小鼠可表现为耳廓发育不良、外耳道缺失，且中耳也可观察到听小骨变形，如锤骨砧骨样变、砧镫关节缺失[55,56]。
在鸡胚中阻断Shh信号通路会导致严重的头部骨骼异常，包括前脑无裂畸形和独眼畸形，这是由NCCs的存活、增殖和定位缺陷引起。其缺失导致了第一鳃弓内大量NCCs凋亡，从而阻止了下颌突内软骨原基Meckel软骨的形成及第一鳃弓内相关结构的发生发展[57,58]，但是目前尚无人类相关报道。
内源性维甲酸在神经嵴处形成，以旁分泌方式发挥作用，其下游靶基因是Hox基因。同时，维甲酸与BMP、FGF和Shh信号通路相互作用，调节CNCCs的准确迁移、分化和发育[59]。在小鼠前脑和面部外胚层中表达的维甲酸合成酶Raldh2和Raldh3双重失活，导致了源自额鼻突的骨骼结构部分缺失。雏鸡头部的维甲酸通过诱导前脑和面部外胚层中的Fgf8和Shh来协调额鼻突的形态发生。表明内源性维甲酸是形成额鼻突及其衍生物(前鼻和上颌前部骨骼成分)所必需的。维甲酸信号通路也可诱导鳃弓的形态发生，维甲酸受体(retinoic acid receptor，RAR)α和RARγ，或RARα和RARβ的双重失活导致鳃弓发育不全和NCCs来源软骨的发育畸形。除了维甲酸缺乏，怀孕期间外源性维甲酸过量或细胞色素P450维甲酸降解酶的失活均可导致颅面部畸形。因此，维甲酸产生及降解之间的平衡对CNCCs来源的颅面部骨骼发育至关重要[34]。
Wnt基因家族成员参与了NCCs的形成与发展，Wnt5a可在外耳间充质中表达，其功能缺失可导致NCCs前后体轴不能延伸，敲除了Wnt5a基因的小鼠表现为耳廓体积减小，对Wnt5a杂合子小鼠进行杂交，结果产生了空胚妊娠[60]。
先天性小耳畸形的发生发展是多因素、多机制共同作用的结果，目前遗传学研究已表明，先天性小耳畸形可能与患者的遗传、环境、生活方式等因素密切相关，与DNA甲基化、非编码RNA调控等表观遗传学改变有关，而各种危险因素背后的影响机制，可能都是通过调控或干扰颅神经嵴细胞的迁移而发生。虽然关于该病的具体病因尚未阐明，但遗传学仍是未来的重要研究方向，包括了流行病学、基因组学、遗传学以及细胞分子生物学等，有望探明小耳畸形具体发病原因及机制。
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