脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)指由脂肪组织分离获得的成体间充质干细胞，因具有多项分化的潜能，且取材容易、来源广泛、体外增殖能力强，故拥有广泛的应用前景。大量实验研究表明，脂肪干细胞在对抗皮肤衰老具有较明显的作用，其作用机制和治疗效果的研究也是当代的医学热点。该文对脂肪干细胞的生物学性质、皮肤衰老的机制、脂肪干细胞抗皮肤衰老的机制和相关实验研究进行综述，并提出亟需解决的问题，为未来干细胞皮肤抗衰老治疗提供参考及借鉴意义。
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脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一种从脂肪组织分离提取的成体间充质干细胞[1]，而脂肪组织的自体储备量大且来源丰富，是一种廉价又无限的干细胞库[2]。1889年Vander Meule首次进行自体脂肪移植术，但治疗效果欠佳[3]。直至20世纪90年代Coleman[4,5,6]提出了改良脂肪抽吸填充技术后，这项技术才得以被全世界广泛应用。2001年加利福尼亚大学的Zuk等[7]从应用于整形手术的脂肪组织中发现了大量的成体干细胞，并命名为脂肪组织提取细胞(processed lipoaspirate cells，PLA)。随着对再生医学的深入研究，ADSCs已经代替了PLA成为公认的名称[2]。ADSCs因能够多项分化、体外增殖能力强、来源丰富，成为了医学美容及整形外科领域最具应用前景的一种干细胞[8,9,10]。其中，ADSCs对皮肤衰老的治疗，正从实验研究逐渐向临床应用转化。以下我们对ADSCs的生物学特性及其抗衰老的研究进展进行综述。
正常成年女性体脂总量高达体重的25%～28%，而人体脂肪约有2/3贮存于真皮层下，所以人体内脂肪组织丰富且广泛分布。随着脂肪抽吸术操作技术的规范化，脂肪组织获取已经变得简单易行。300 ml的脂肪组织包含了(2～3)×108个ADSCs，比骨髓中的间充质干细胞多100～1 000倍[11,12,13,14]。
大量实验发现，ADSCs具有损伤修复及对抗衰老的作用。其一方面可以定向分化，代替老化及缺损细胞[15]，另一方面可通过分泌及旁分泌作用，刺激周围的细胞分化成特定的细胞[16,17,18]。ADSCs分泌的细胞因子主要分为4大类：血管源性因子、造血源性因子、生长因子和炎症因子。其中，血管源性因子包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素(angiogenesis，Ang)等；造血源性因子如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等；生长因子如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、转化生长因子(TGF)、胎盘生长因子(PGF)等[19,20,21]；炎症因子种类较多，Blaber等[22]曾在ADSCs的条件培养基中共发现18种炎症相关因子，包括8种促炎因子、4种抗炎因子及6种趋化因子。
除此之外，ADSCs还可以分泌一种微囊泡(microvesicles，MVs)，MVs是一种脂质双层膜结构的亚细胞颗粒，其直径为50～1 000 nm [23,24]。ADSCs分泌的MVs不仅富含与母细胞相似的活性物质，还具有促进细胞生长、组织再生、创伤修复的功能，是研究组织再生修复的又一热点[25]。国内曾有实验证明了单一供体来源的MVs与多个供体来源混合的MVs对成纤维细胞的抗衰老效果没有显著差异，为未来进行多供体来源混合MVs抗衰老提供了一定的实验基础[26]。
人体内的细胞是有广泛的相互联系的抗氧化防御机制，保护细胞免受活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)引起的损伤，而这些机制中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物歧化酶(glutathione peroxidases，GPX)等抗氧化酶，在清除细胞内残留的ROS的过程中最为重要[27]。SOD是一种可以催化超氧化物阴离子向O2和H2O2歧化的金属酶，在细胞抗氧化防御机制中起到关键作用[27]。一直以来铜锌超氧化物歧化酶(copper/zinc SOD，Cu/Zn-SOD)和锰超氧化物歧化酶(manganese SOD，Mn-SOD)均被认为是防御氧气毒性的重要物质[28]。但是随年龄增长，SOD、GPX等抗氧化酶的活性下降，自由基的内源性清除能力下降，导致体内自由基积累量增加。而紫外线的照射又诱导了ROS的累积，从而导致了皮肤呈现衰老的状态。但令人欣喜的是，许多研究都报道在经过ADSCs治疗后的小鼠体内SOD呈上升趋势[27,29]，与此同时，ADSCs还能捕捉缺血状态下的自由基和热休克蛋白[2]，证明ADSCs具有很好的抗氧化、抗衰老作用，也部分解释了ADSCs的抗衰老机制。
据文献报道，即使缺氧的条件下，ADSCs仍能够保持较好的细胞活性[30]。当氧浓度低至1%～5%时，更可促进ADSCs的增殖分化。缺氧在促进缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)表达的同时，也诱导了促血管生成的VEGF、bFGF和HGF等细胞因子的分泌，这些分子的受体在ADSCs表面表达，从而启动对ADSCs的刺激，最终使ADSCs增殖、微血管形成；与此同时缺氧也会诱导ROS形成，而ROS作为信号分子又可以增加血管增生[16,31]。ADSCs的这一特性可使其在体外实验分化扩增时避免缺氧而导致的坏死，为未来扩增后的自体或异体移植具备更多的可能性。
相关实验证明ADSCs会随人体衰老而衰老，出现端粒变短、端粒酶活性减弱的特性，其增殖分化及合成分泌的活性降低，血管生成因子分泌减少[32]。这可能会导致未来老年患者进行自体细胞治疗时效果大打折扣。
人体皮肤衰老是指因时间因素或受外源刺激导致的皱纹加深增粗、色素沉着、弹性下降、角化不良等一系列改变。而紫外线是导致皮肤衰老主要元凶[33]。日常生活中，紫外线的辐照导致的光老化常常与时间造成的自然老化相互叠加，难以真正分离，所以人们常常通过研究皮肤光老化来代替皮肤衰老。
外观上的皮肤光老化常常表现为皱纹数目增多及加深、皮肤弹性下降、皮肤局部凹陷、皮肤表面干燥且角化不良等。这是真皮层变薄、成分比例发生变化所致。真皮主要由各种纤维组成，如Ⅰ型胶原纤维、Ⅲ型胶原纤维和弹性纤维，其中以Ⅰ型胶原纤维占比最多[34,35,36]。光老化的皮肤中Ⅰ型胶原纤维含量大幅度降低，Ⅲ型胶原纤维相对增多，弹性纤维断裂变性，从而导致皮肤外观改变。
从细胞层面上看，真皮中的主要成分由真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts，HDFs)合成，而当HDFs受到细胞因子的调节或外源性刺激时，可发生衰老、凋亡、受损及数量减少，从而导致真皮中胶原蛋白合成减少[37,38,39]。
从分子层面上讲，紫外线(ultraviolet，UV)照射皮肤诱导ROS产生，ROS在缩短端粒促进细胞衰老的同时导致线粒体DNA损伤；同时ROS还可以诱导核转录复合物活性蛋白(active protein，AP-1)的活化。AP-1既可以通过阻止转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)转录和降低TGF-β受体水平，抑制HDFsⅠ型前胶原基因表达，还可促进基质金属蛋白酶β(matrix metalloproteinase，MMP)家族的基因转录，从而促进胶原降解。此外，胶原降解片段的积蓄又抑制了HDFs合成前胶原蛋白，使胶原含量进一步下降[40,41,42]。ROS的累积还可以导致细胞的氧化损伤，产生花生四烯酸，其被催化后转化为前列腺素，而前列腺素的产生可使炎性细胞聚集，导致炎性反应，进一步加重对老化皮肤的损伤[40]。
目前为止，关于ADSCs抗皮肤衰老的机制还处于实验探索阶段，已有多篇文章及研究从各种角度解释了ADSCs的抗衰老作用机制，现普遍公认的是ADSCs抗衰老作用与其分泌的细胞因子、MVs及微环境相关。
抵抗皮肤衰老，减少皱纹形成，其最重要的机制便是抑制胶原的降解、促进胶原的再生。ADSCs主要通过降低MMP家族的含量来降低胶原降解，达到抗衰老的作用[43]。胶原的再生有赖于HDFs的激活。当HDFs功能降低时，其产生的胶原量便会减少，增殖能力下降，细胞数目降低[44]。ADSCs可刺激HDFs增殖，减少其凋亡[44]，增强其功能[45]，从而促进胶原的再生。Kim等[46]用ADSC悬液注射到UV照射8周后的无毛小鼠皮下，发现皱纹得到改善，真皮层增厚，验证了ADSCs可以激活HDFs，促进胶原合成，减少因中波紫外线(ultraviolet B，UVB)诱导的HDFs细胞凋亡。Jeong等[29]分别使用了ADSC悬液和HDFs悬液来治疗经过UVB照射的裸鼠，发现ADSCs治疗皱纹效果更好，并认为其原理是ADSCs减少了UVB诱导的细胞凋亡、刺激HDFs合成胶原。Wang等[45]通过实验验证了HDFs无论是否经过UV照射，ADSCs条件培养基(conditioned medium of ADSCs，ADSC-CM)对其都具有降低凋亡、改善功能的作用，他认为其抗衰老机制是ADSC-CM中具抗氧化活性作用的细胞因子，可以刺激细胞增殖并减少细胞凋亡，而其中促分裂作用的细胞因子如TGF-β1和基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)具有促进细胞分裂的作用，其作用机制与Wnt/β-catenin通路的作用下通过级联反应刺激细胞mRNA合成相关。
SOD酶是体内清除ROS的重要活性酶，而ADSCs可以维持SOD的酶活性及含量[47]，降低ROS的含量[26]，进而减少胶原的降解，维持皮肤的活力。Park等[47]将ADSCs悬液(1 ml HBSS平衡盐溶液配1×106个细胞)和ADSC-CM分别注射到小型猪的背部皮肤，发现两者均可以增加胶原含量，并且通过相关分子实验验证了ADSCs可对SOD的含量进行保护，从而达到抗氧化的作用。郭吉安[26]将ADSCs、MVs分别与老年人的HDFs行Transwell共培养，发现MVs和ADSCs可以降低HDFs细胞内衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)和ROS的含量，从而具有抗衰老的功能，且ADSCs抗衰老的能力比MVs更强。
最新的研究表明，ADSCs-CM可以下调不同种类型刺激诱导的单核细胞/巨噬细胞的活化，并且可以控制相关的促炎功能[48]。其机制为：首先ADSCs-CM可以减少在组织损伤中具有重要作用的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNFα)；其次ADSCs-CM还可以降低细胞表面脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激产生的前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)，这类花生酸类物质具有促进水肿及MMPs合成的作用；最后ADSCs-CM可以减少单核细胞的迁移，从而减少单核细胞介导的组织的损伤[48]。
外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSCs)分泌的囊泡状小体，包括了MVs和外泌体，其主要成分有细胞因子、生长因子以及RNA。ADSCs分泌的EVs可以促进人角质形成细胞和HDFs的增殖、迁移和活化，从而促进创口愈合，且EVs即使在敲除促进上皮细胞迁移AKT通路依赖的miR-205情况下仍能促进上皮细胞迁移、促进皮肤愈合[49]。有实验证明，无论是否在缺氧的条件下，MSCs分泌的Evs均具有抗炎作用[50]。
皮肤衰老的重要临床表现之一就是血管数量减少、管径减小、结构紊乱等。ADSCs促进血管生成的作用机制主要有2种学说[51]，一是认为其分泌的生长因子具有促进血管形成的作用[52]，二是认为ADSCs在刺激下可以被诱导并分化为血管内皮细胞[53]。最近更有实验研究表明ADSCs甚至可通过上调HIF-1α/VEGF途径促进糖尿病缺血皮肤新生血管形成[54]。
ADSCs具有抑制酪氨酸酶活性的作用，这意味着ADSCs不仅可以抵抗皮肤衰老，还可以抵抗皮肤因紫外线辐射导致的黑色素的形成，从而达到美白皮肤的效果[55]。Kim等[56]进行了体外B16黑色素瘤细胞实验，证明ADSCs分泌的因子可以抑制黑色素合成。隋冰等[57]通过将ADSC悬液注射到经UVB照射的裸鼠皮下，并做Fontana-Masson染色，观察到ADSCs具有降低皮肤黑色素含量的作用。
ADSCs不同于药物，由于其机制不清、性质不稳定及致瘤性等原因，目前经过体外扩增和培养的ADSCs尚不可进入临床试验。而ADSCs分泌的细胞因子以及其培养基上清液等，因可以避免伦理问题，成为现在临床转化试验的对象。2008年Park等[47]将自体纯化脂肪细胞(purified autologous processed lipoaspirate，PLA)以1 ml HBSS平衡盐溶液配1×106个细胞比例，注射到1例光老化患者面部皮肤中，并在注射后2个月发现皮肤纹理和皱纹得到改善，真皮厚度增加。2012年田雅光等[9]利用患者自体脂肪颗粒及经传代培养的第3代ADSCs进行复合，注射于患者的凹陷性皱纹处，与单纯除皱术患者进行对比，通过VISA测量仪检测发现2组患者皱纹改善程度相当。2017年Wang等[58]使用微针将ADSCs蛋白提取物(aape®)注射到受试者皮肤中，并通过VISA测量仪、黑色素测量仪、光泽计、三维光学测量装置、皮肤弹力检测仪及调查问卷的方式，发现用微针经皮注射ADSC培养基分泌蛋白(aape®)可以改善皮肤粗糙度、降低黑色素含量、增加皮肤亮度、光泽、弹性和抗皱等。
干细胞和再生医学是继药物和手术治疗后的第3种疾病治疗途径[59]。ADSCs的研究正逐渐由基础原理研究向临床试验转化。我们希望未来ADSCs可以像玻尿酸一样，通过简单的几次微创注射，即可以达到长效、安全、既可美白又可改善皱纹的疗效，甚至改善全身体质，达到由内而外年轻的效果。但是目前ADSCs的广泛临床应用还存在许多亟需解决的问题。
第一，虽然ADSCs来源丰富，但年龄对其的活性影响很大[32]，这意味对于急需改善皮肤衰老状态的年龄较大患者来说，自体ADSCs并非首选，需要使用青年人的优质ADSCs，然而目前无论是脂肪移植还是带有高密度脂肪干细胞的脂肪移植，异体移植都是不被允许的。但是ADSCs分泌的因子或其MVs却可以避免伦理问题，或许可以成为未来的发展方向。
第二，虽然ADSCs取材容易培养方便，但不同研究单位制备方法和质量控制仍有差异，因此我们需要建立ADSCs的培养标准及质量控制体系，保障其治疗标准和效果[60]。
第三，ADSCs的抗衰老作用机制有待进一步确认，现在大多认为其对抗皮肤衰老与旁分泌和微环境的作用相关，但其分泌的细胞因子及培养液十分复杂，可能还存在人类尚且未知的蛋白及细胞通路，难以确保其安全性及稳定性。
第四，虽然目前尚无ADSCs移植后成瘤的报道，但对于影响ADSCs分化和调控的因子尚不清楚[61]，且关于ADSCs的临床研究少，观察时间短，仍需持续的基础研究和临床随访观察。
第五，局部应用ADSCs是否会影响机体其他器官？是否会远处转移？是否会导致全身的不良反应？曾有文献称，局部应用ADSCs可以引起全身性血清中信号分子水平升高[60]。所以对ADSCs局部应用的全身安全性问题还需要进一步的研究证明。
ADSCs确实具有增加皮肤胶原含量、改善真皮成纤维细胞功能、改善皮肤光衰老和光损伤的疗效。虽然还有许多问题有待进一步解决，但随着科技的发展，ADSCs疗法必将作为未来医学抗衰老治疗的一种重要手段，为抵抗人类皮肤甚至全身的衰老带来新的福音。
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