颅外动静脉畸形(arteriovenous malformation, AVM)作为一种高流量脉管畸形，目前以手术和无水乙醇介入为主的治疗风险较高，且复杂颅外AVM的预后不佳。因此，在遗传学和病理机制的研究基础上加速靶向治疗的研究是该领域的当务之急。近年来颅外AVM的遗传学研究突破性地发现了该疾病存在RAS/RAF/MAPK通路相关基因的体细胞突变，基因多态性和表观遗传学可能在病理机制中同样具有潜在价值。目前多种抗血管生成治疗显示对颅外AVM可能存在治疗作用，另一方面高通量蛋白组学为颅外AVM的精准治疗提供了新的思路。该文从以上几个方面对近期颅外AVM相关的病理机制、遗传学和靶向治疗的研究进展进行了综述。
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颅外动静脉畸形(arteriovenous malformation，AVM)是一种高流量的脉管畸形，其表现为动静脉之间直接沟通，缺乏正常的毛细血管床，受累血管扩张、缠结形成畸形血管团，合并病理性静脉高压[1]。颅外AVM多数表现为散发性，部分为家族遗传性，患病率无性别差异[2]。目前研究中述及的颅外AVM通常指排除内脏(脑、肺、消化道等)的皮肤软组织AVM，少数累及软骨或骨，累及部位以头颈部最常见(77.1%)，其次是四肢(20.9%)，躯干部少见(2.0%)[2,3,4]。颅外AVM的治疗方式以手术切除和血管内治疗为主，但部分复杂病例缺乏有效的治疗方式，往往由于溃疡、出血和心功能不全等严重并发症被迫面临截肢甚至生命危险。已有学者对颅外AVM的诊治进展及关键性问题进行了论述[5]。因此，阐明颅外AVM的遗传学与病理机制，并以此为基础探寻靶向治疗方案是当前该领域的重中之重，我们对此方面的研究进展进行了综述。
AVM是一种具有高度动态性的病变，表现为快速生长、重构、退缩，甚至切除后原位形成[6]。目前普遍认为AVM的发生发展与血管生成和动静脉分化异常有关[7]。部分学者提出AVM与血管生成早期的动静脉分化的缺陷有关，主要表现为肝配(Ephrin)蛋白失衡，尤其是EFNB2与EPHB4。Hedgehog(Hh)-VEGF-Notch信号是该过程的关键信号通路，该通路活化后，EFNB2可发生过表达，导致血管无法分化成静脉[8]。另一方面，由于血管生成素(angiopoietin, Ang1，Ang2)及其受体TIE-2受血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的调控，在促血管生成与抗血管生成中发挥重要作用，因此TIE-2-血管生成素系统失衡可能与AVM的病理过程相关[6]。部分研究在动物模型和人AVM标本中发现AVM血管周细胞的覆盖明显减少，这可能与AVM的通透性增强、炎性反应浸润、微出血等现象相关，并为血管生成活化提供了证据支持[9]。近期有学者对颅内与颅外AVM的病理差异进行了对比，发现颅内AVM更多表现为血管内的炎性反应，以显著的中性粒细胞和淋巴细胞浸润为主，而颅外AVM则更多为肥大细胞和中性粒细胞浸润为主的血管外炎性反应。并且在所有颅外AVM均观察到了微血管增殖，而颅内AVM则仅有部分表现为局灶性的微血管样改变。颅外AVM显著的炎性反应和微血管增殖病理表现，进一步提示了活跃的血管生成状态[10]。
一些研究显示动静脉畸形的信号通路异常与血流动力学密切相关。对Smad4基因敲除的小鼠AVM研究发现，高流速与动静脉畸形的形成密切相关，血流可诱导PI3K/AKT信号的活化，而骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein, BMP9)可通过活化素受体样激酶1(activin receptor-like kinase 1, ACVRL1或称ALK1)抑制这种流速诱导的血管生成活化[11]。有学者将颅内AVM与另一种颅内常见的脑海绵状血管畸形(cerebral cavernous malformations, CCM)对比分析，在分子表达模式上AVM更趋于成熟的血管，并存在血小板源性生长因子-A(platelet derived growth factor-A, PDGF-A)的高表达，提示AVM可能是由成熟的内皮对血流动力学做出应答，最终导致血管重构[8]。尽管目前基于临床标本和遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT)相关基因缺失动物模型的研究，形成了许多关于颅外和颅内AVM病理机制的推论，但由于缺乏散发型AVM的动物模型，后者的病理机制仍然缺乏准确的认知。因此，颅外散发型AVM的遗传学发现是建立该疾病准确的动物模型的重要基础。
颅外AVM的遗传学一直是该领域的研究热点。对于家族遗传性的AVM，既往研究已经发现许多明确的致病基因，其中HHT(或称Rendu-Osler-Weber综合征)相关的5个突变基因，均累及转化生长因子β(transforming growth factor-beta, TGF-β)和BMP9/10信号通路，包括导致HHT1的内皮糖蛋白(endoglin, ENG)基因突变，HHT2的ALKS1基因突变，以及婴幼儿息肉/HHT综合征的SMAD4的编码基因突变。另外与HHT3和HHT4相关的2个染色体位点分别位于5q和7p14，但突变基因尚不明确。导致HHT5的突变基因为ALK1的配体——BMP9的编码基因。另外，一种可表现AVM的混合性血管畸形——毛细血管畸形-动静脉畸形也已发现了RASA1和EPHB4两种主要突变基因[1,8]。
近年来，借助高通量测序技术，颅外散发型AVM的遗传学取得了突破性进展。通过全外显子测序和全基因组测序和微滴数字PCR, 有学者发现并验证了MAP2K1体细胞突变与颅外AVM的相关性，其中64%的标本检测到了MAP2K1突变，并发现该突变仅存在于内皮细胞中，突变等位基因频率(mutant allele frequency, MAF)为35%。该突变可能会组成性地增加MEK1的活性，并促进下游ERK1/2分子的磷酸化，但仍需比较MAP2K1突变在AVM与肿瘤中所产生的效应异同，才能理解该突变对于AVM内皮细胞功能的影响和面对环境应激(例如组织损伤和缺氧)时发挥的作用[12]。而Al-Olabi等[13]则在颅外散发型高流量脉管畸形中分别检测到了KRASQ61H，G12V、BRAFV600E和MAP2K1的镶嵌突变，并通过相应基因突变在斑马鱼中诱导形成脉管畸形。近期Konczyk等[14,15]在面部AVM伴随皮下脂肪过度生长的病例中发现内皮细胞HRAS突变(MAF为31%)；相似地，在伴随软骨过度生长的耳部AVM病例中则发现内皮细胞MAP2K1突变(MAF为51%)，研究者由此推测血管畸形中的组织过度生长均为细胞非自主机制(cell-non autonomous mechanism)，即突变的内皮细胞与其他组织细胞发生动态的相互作用，而非不同种类细胞的突变导致各自组织过度生长。Goss等[16]在与AVM存在表型重叠的肌内血管瘤毛细血管型(intramuscular hemangioma capillary type，IHCT)中同样发现KRAS与MAP2K1体细胞突变(MAF为2%～15%)。近年来多项脑与脊髓AVM的遗传学研究中同样发现了多种类型的KRAS与BRAF突变，提示颅外与颅内AVM的遗传学具有高度的相关性[17,18,19,20]。综合颅外与颅内AVM的遗传学研究结果，高度提示RAS/RAF/MAPK信号通路在AVM的表型和发生发展中扮演着极为重要的角色，亟需更多相关的生物学研究揭示该信号通路在AVM的血管发育和血管构筑异常中的意义，以及该通路与血流动力学和其他环境因素的相互作用机制。同时，建立基于上述信号通路相关基因的颅外AVM动物模型，将极大提升对AVM发生发展机制的准确认识，并指导靶向治疗的研发。
除此之外，许多证据支持AVM的基因多态性特点与疾病的进展和并发症风险密切相关。对于颅内AVM来说，研究者往往关注颅内出血风险，既往研究提示，促炎性细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子-α、白介素-1、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase，MMP-9)等，以及血管生成相关基因(如ENG、ALK1、NOTCH4等)的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism, SNP)与脑AVM的进展或出血风险相关[21,22,23,24]。暴露于慢性缺氧、激素水平波动、血流动力学改变等环境条件下，白介素基因的SNP可能会增加病变进展风险，导致成人期散发型AVM的进展[8]。Wei等[25]也证实了MMP-9与颅外AVM疾病进展具有相关性。尽管病理学和生物学研究高度提示血管生成、炎性反应相关分子与AVM发展具有相关性，但目前针对颅外AVM的基因多态性和遗传易感性研究仍然处于空白，相关研究可能有助于更加深入认识颅外AVM的病理机制。
有学者提出，AVM可能存在异常的表观遗传学背景。一些研究已经显示，PDGF-D和细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A基因的DNA甲基化，可能与脑AVM的发生具有相关性[26,27]。DNA甲基化水平对调控血管内皮功能至关重要，如内皮NO合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因启动子的甲基化水平对血管功能具有调控作用，而消除甲基结合蛋白，则可能导致eNOS和VEGFR2基因表达活化，刺激血管生成信号通路，诱导AVM发生；此外，动静脉形态和功能差异也可能与动静脉内皮细胞基因组的DNA甲基化水平差异有关[6]。另一方面，血流动力学可能是调节AVM的表观遗传背景，决定内皮细胞命运的重要因子。AVM供血动脉巨大的管壁剪应力和环周拉应力可激活内皮细胞，导致MMP-9、PDGF和VEGF表达增加，从而诱导血管重构；一些研究也发现，组蛋白乙酰化酶能够对血流震荡和剪应力发生应答，进而调节内皮细胞增殖或血管生成过程[6]。因此，进一步探究血管发育和血管生成相关通路基因的表观遗传学修饰，可能对理解AVM发展过程中的异常分子表达及其与血流动力学之间的关系具有重要价值。
由于AVM中血管生成信号通路明显异常，抗血管生成治疗一直是AVM靶向治疗研究的主要方向。目前针对VEGF的抗血管生成治疗显示出较大潜力。一项对20家医疗中心共150例接受全身贝伐单抗(bevacizumab)治疗的HHT相关高输出量型心衰(high-output cardiac failure, HOCF)患者的调查中，55%的中心报告多数病例心指数和HOCF症状获得改善，尽管心脏指标完全恢复正常并不常见[28]。在HHT2中，内皮细胞特异性Alk1基因纯合性失活以及阻断BMP9和BMP10配体可诱导小鼠AVM形成，并导致VEGF和PI3K/AKT信号增加。基因敲除VEGFR2可以阻止过度的血管生成，但不能完全逆转AVM形成；而药物抑制PI3K可以不仅可有效阻止AVM形成，并可逆转已形成的AVM，因此PI3K通路可能作为新的HHT2相关AVM的治疗靶点[29]。另外，对Alk1敲除小鼠注射抗血管生成剂沙利度胺或来那度胺，观察到脑AVM异常血管数量和出血减少，提示沙利度胺对治疗AVM或抑制疾病进展具有潜在价值[30]。Notch家族作为血管生成信号中的下游分子，在多种颅外血管畸形中异常表达，γ-分泌酶抑制剂可抑制Notch靶基因表达和内皮细胞迁移，由于在其他疾病中已开展临床研究，因此该药物同样具有作为颅外AVM靶向治疗的可能性[31]。
mTOR受体抑制剂西罗莫司在静脉畸形、淋巴管血管畸形和许多复杂血管畸形的治疗中具有良好的效果。但在AVM的治疗方面效果并不确切[32]。有报道采用血管内治疗与口服西罗莫司相结合的方式治疗6例复杂颅外AVM，所有患者均显示出积极的治疗反应，其中4例几乎完全缓解(体积减少75%以上，症状明显缓解)[33]。但对于手术或介入治疗效果不佳的病例，西罗莫司的治疗效果并不理想，Gabeff等[34]报道了10例口服西罗莫司(剂量为0.6～3.5 mg/m2) 治疗AVM的结果，其中5例完全无反应，5例有部分反应，有2例在随访过程中出现疾病进展。Triana等[32]报道的4例AVM则对口服西罗莫司均无反应。Maynard等[35]观察了1例颅内AVM合并脑颅皮肤脂肪瘤病的患儿口服西罗莫司治疗6个月的情况，随访结果显示癫痫和鼻出血症状发作明显减少，血管病变稳定，没有进展，但病灶并无消退表现。因此，西罗莫司对颅外AVM的疗效仍缺乏证据支持。
随着颅外AVM在遗传学上的突破性进展，有学者对利用MEK抑制剂曲美替尼治疗复杂AVM的效果进行了观察，初步显示曲美替尼可缩小AVM体积，相较西罗莫司具有更好的治疗反应[36]。另外，在颅外AVM发现BRAFV600E突变的研究中，也观察到BRAF抑制剂维罗非尼可恢复BRAFV600E突变诱导的斑马鱼血管畸形的血流模式，提示具有潜在的靶向治疗的可能。然而需要注意的是，BRAF和MEK抑制剂均为细胞抑制剂而非细胞毒性药物，该类靶向药物对颅外AVM治疗的安全性和有效性仍需进一步验证[11]。总体上，目前AVM的抗血管生成相关靶向药物治疗，仅可一定程度上缓解疾病或相关并发症的症状，而真正对AVM有确切疗效的靶向药物仍然缺乏，但随着遗传学发现和新靶点的研究，当前困局则有望被打破。
有学者提出，可以利用病理性的内皮细胞在血管生成或炎性反应过程中上调的受体作为靶点，或利用先前治疗或条件(如放射线、热休克、超声、内毒素、药物等)造成的病变内皮细胞分子在局部表达的改变，然后通过与生物技术结合，实现靶向血管血栓形成或闭塞[37]。由于蛋白质组学的高通量分析能力可以大量检测蛋白水平的分子表达和定位改变，因此在分析特征性标记物和潜在靶点上具有独特优势。
对于脑与脊髓AVM，目前已经有一些蛋白组学的初步探索。Wang等[38]对人脑AVM与正常脑血管和正常脑组织进行TMT标记的蛋白组学分析，发现AVM组织在紧密连接、局部黏附和缝隙连接等信号通路相关的蛋白均发生了显著的改变，提示AVM组织内细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用存在异常，其中主要包括局部黏附分子-整合素 α5β1上调和Ⅳ型胶原的下调，部分紧密连接相关蛋白、缝隙连接相关蛋白GJA1(或称Connexin 43)和肌球蛋白等分子的上调则提示了脑AVM活跃的血管生成特性。对脊髓AVM标本进行的蛋白组学差异分析同样显示了血管生成和局部黏附通路的改变，包括在血管生成和多种血管性疾病中发挥关键作用的MMP-9的上调和金属蛋白酶抑制物3的下调，和在血管发育中发挥重要作用的VEGFR1和下游分子PLCG1与AKT1的下调[39]。对于颅外AVM是否存在相似的蛋白表达改变，高通量的蛋白组学研究可能有助于快速分析，并据此寻找治疗靶点。
利用蛋白组学筛选得到的AVM特异性靶点进行干预，可能成为当前AVM靶向治疗新的研究策略。目前已经有学者利用放疗后内皮细胞的特异性标记物开展靶向治疗的基础研究。Subramanian等[40]以放疗后内皮细胞外转的磷脂酰丝氨酸为靶点，给予配体导向的血管靶向剂——Annexin V-血栓素和搏动性血流处理，可在放疗后的内皮细胞上观察到特异性血栓形成。Gauden等[41]在此基础上，利用小鼠颈外静脉-颈总动脉吻合模型验证了该血管靶向剂诱导放疗后AVM血栓形成的特异性。值得注意的是该研究仅从理论上验证了放疗后诱导AVM内皮细胞特异性血栓形成的可行性，但并未采用血管生成相关基因缺失的动物模型，与AVM病变表型仍有较大差距，仍需进一步验证。尽管如此，上述研究仍提供了一种新的思路，即通过颅外AVM的标志性靶点或通过与其他技术结合诱导特异性蛋白表达或转位，实现颅外AVM的靶向干预。
颅外AVM的病理机制一直围绕着血管生成信号通路展开，但AVM发生发展过程中异常的血管生成信号网络仍未完全阐明。近年来，遗传学的重要突破为颅外AVM分子机制提供了新的认识，同时AVM的表观遗传学修饰及其与血流动力学和环境因素的相互作用同样值得关注。颅外AVM的靶向治疗，一方面迫切依赖于对AVM的遗传学与分子机制的突破性研究，另一方面，高通量蛋白组学可能在寻找颅外AVM的标志性靶点方面具有潜在价值，或可为靶向治疗提供新思路。基于抗血管生成的靶向治疗目前仍缺乏确切的有效性证据，亟需更多临床研究提供支持，而AVM的蛋白组学研究尚处于起步阶段，积极开展相关研究有望为颅外AVM的精准治疗打开新的局面。相信基于目前遗传学和高通量组学技术的支持，该疾病将在精准治疗方面不断取得重要进展。
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