新型冠状病毒肺炎正在中国肆虐，特别是在湖北武汉，对人民生命健康和经济造成了极大的损失。根据中国疾病预防控制中心（Chinese Center for Disease Control and Prevention，CDC）指南，新型冠状病毒肺炎患者的确诊及治愈均需核酸检测结果确认。上呼吸道取样方法是核酸检测的主要样本来源，但在各国CDC发布的指南中只提出了上呼吸道取样方法，并未提出推荐级别。因此，患者就诊时该选择怎样的取样方法、何种取样方法医护人员的安全性最高成为我们关注的问题。本文对近年来世界范围内流行的严重急性呼吸综合征（SARS）、中东呼吸综合征（MERS）、甲型H1N1流感等传染性疾病相关上呼吸道取样方法研究共10篇文献进行了综述。从取样方法、取样时间、医护人员安全性3个维度整理了收集的文献，发现在所有上呼吸道取样方法中，鼻咽抽取物（NPA）在发病2周内具有较高的阳性率，鼻腔+口咽联合拭子（NS+OPS）对取样操作的医务人员危害最小。期望本综述能对此次疫情的防控提供一些参考。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
2019年12月，我国湖北省武汉市暴发了新型冠状病毒肺炎疫情。随着疫情发展，截至2020年2月22日24时，据31个省（自治区、直辖市）和新疆生产建设兵团报告，累计报告确诊病例76 936例（其中重症病例10 968例），累计治愈出院病例22 888例，累计死亡病例2 442例[1]。从当前流行病学调查结果来看，新型冠状病毒肺炎主要特征为：（1）主要为经呼吸道飞沫传播和密切接触传播，特定环境中存在气溶胶传播可能，粪口等传播途径尚待明确；（2）人群普遍易感（R0约为3.77）[2]，潜伏期为1~14 d，多为3~7 d；（3）临床症状多变，以发热（98.6%）、乏力（69.6%）、干咳（59.4%）为主要表现，其他临床症状包括厌食、肌痛、咽痛、呼吸困难、流涕、腹泻等或无明显症状；（4）有效药物和病毒疫苗尚处研发阶段，目前主要治疗方法为对症治疗，防控形势严峻。
在国家卫生健康委员会公布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》[3]中，新型冠状病毒肺炎确诊条件为：实时荧光定量反转录聚合酶链反应（real-time PCR，RT-PCR）检测新型冠状病毒核酸阳性，或病毒基因测序与已知新型冠状病毒高度同源。特别建议结合胸部CT病毒性肺炎表现（主要为毛玻璃样阴影和/或双肺斑片状阴影）进行诊断。但目前核酸检测对于新型冠状病毒肺炎患者阳性率偏低，约33.2%[4]，主要原因为：（1）病毒滴度在不同检测时间、不同部位并不相同；（2）送检标本多样，包括血液、痰液、咽拭子（oropharyngeal swab，OPS）、鼻咽拭子（nasopharyngeal swab，NPS）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）等；（3）由于疫情暴发突然，检测试剂盒的质量、标本运送等环节容易出现问题。上呼吸道是许多医疗机构采集初筛感染者样本的主要部位，采样方法包括OPS、NPS、鼻咽吸引物（nasopharyngeal aspirate，NPA）、鼻咽洗液（nasopharyngeal wash，NPW）、鼻腔拭子（nasal swab，NS）、鼻腔吸引物（nasal aspirate，NA）、鼻腔洗液（nasal wash，NW）、鼻腔+口咽联合拭子（combined nasal and oropharyngeal swabs，NS+OPS）等。但面对患者人数众多、发病时间不一致、医护人员被感染风险巨大等难题时，如何选择上呼吸道标本取样方法，目前尚无定论。
各国疾病预防控制中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）对于呼吸道病毒上呼吸道采样方法均有指南建议和详细方法指导，但无推荐等级。因此，我们希望通过总结严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）、中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）、甲型H1N1流感等传染性疾病呼吸道样本取样方法的研究文献，主要从取样方法、取样时间、取样安全性3个维度出发，给予不同上呼吸道取样方法差异化推荐，期望能帮助尽快控制疫情，让国民尽早恢复正常生活。
我们参考了国内外最新的新型冠状病毒肺炎诊疗指南，选取有代表性的国际卫生组织及国家（WHO、美国、澳大利亚、英国）的4份和中国发布的5份指南进行总结。4份国际指南的样本采集在下呼吸道样本一致，包括痰（漱口后深咳）、BAL、气管吸引物（tracheal aspirate，TA），但无推荐等级。而在上呼吸道样本取样方面存在较大差异。如WHO建议行NPS+OPS[5]；美国CDC建议取NPS、OPS（主要为咽后壁）、NPS或NPW或NA，并指出勿用藻酸钙拭子或者木质轴拭子取样（我国普遍使用的咽拭子材料为木轴）[6]；澳大利亚公共卫生实验室网络（Public Health Laboratory Network，PHLN）建议的样本采集类型为NPS和或OPS（明确包括扁桃体窝）、NA或NW[7]；英国公共卫生部（Public Health England，PHE）则较为不同，建议行NS+OPS、OPS、NS、NPA这几种方法[8]。4份指南皆有权威性，但上呼吸道取样方法建议不同，有些则对采集装置有严格要求，如美国CDC。在临床实践中，数以万计的检测样本将会放大这些差异，影响病毒检测、控制及研究。
在国内，武汉同济医院[9]、北京协和医院[10]，他们发布的指南均建议取"痰液、OPS、下呼吸道分泌物等标本"，国家卫生健康委员会发布的前4版新型冠状病毒肺炎诊疗方案建议取样内容同上，而在最新的第六版中为"NPS、痰液、下呼吸道分泌物等标本"。此修改虽只一字之差，但取样方式完全不同。OPS取样部位为扁桃体窝及咽后壁，NPS取样部位为鼻咽部，两者取样方法及取样难度完全不同。指南修改的原因可能是在一些呼吸道病毒的检测阳性率上，NPS的阳性率高于OPS[11]。
我们分析比较国内外指南上呼吸道标本取样建议，发现国内指南存在一些缺陷：（1）建议取样类型较为单一，上呼吸道标本取样只有两种方式：OPS和NPS，未提及NS+OPS及NPA等方法；（2）内容简单，对取样方法和取样装置未予具体指导；（3）对于不同发病时间点、医疗条件及要求下的取样方法，无详细的推荐级别；（4）对于首次检测阴性，但临床高度怀疑的患者，未说明再次取样的方法，而WHO指南"对于强烈怀疑为新型冠状病毒肺炎但初始检测为阴性的患者"，建议从呼吸道多位点如鼻部、痰液、气管抽吸物重新采样。
综合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》和《WHO-2019-nCoV-Surveillance Guidance（2020-01-31）》2份指南，对于新型冠状病毒，显然下呼吸道标本比上呼吸道标本的诊断价值更高，临床标本应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本，尤其是下呼吸道标本，包括深咳痰、TA、BAL等，但其有一定的局限性及难度。深咳痰取样的缺陷：（1）部分患者临床症状无咳痰，且儿童和老人不易配合；（2）痰液黏稠度高，提取核酸需要额外预处理程序，而预处理程序尚未标准化，使用不当会影响检测结果[12]；（3）呼吸道病毒大多通过呼吸道飞沫等传播，深咳痰增加了医护人员及其他患者的感染概率。其他如TA和BAL都需要支气管镜、抽吸等装置，取样难度高，耗时长，需要麻醉人员配合，医护人员暴露风险高，不适合作为临床常规筛查。因此，通常情况下，医护人员会首先采取上呼吸道采样方法。
对于上呼吸道样本采集方法，主要有NS、NPS、NPA、OPS、NS+OPS及中鼻甲拭子（midturbinate swab，MTS）等。通过对既往发生流行的呼吸道疾病如SARS、MERS、H1N1的研究发现，病毒样本的阳性率与取样方法、取样时间密切相关，是直接影响病毒早期筛查敏感度的关键因素。在新型冠状病毒肺炎患者中，我们注意到早期感染的部分患者为医护人员。面对具有强传染性的疾病和大量的感染患者，采样时如何保护自身，是选取采样方法时必须考量的因素。目前新型冠状病毒肺炎防控形势严峻，一线临床医护人员每天检测的样本数以千、万计，而其中比例最大的是上呼吸道样本，样本取样方法的选择直接影响病毒筛查效率。不同的样本采集方式存在不同的灵敏度和特异度，因此了解每种采集方式的优势和局限性、选取"检出率高、采集简易、安全性好"的标本非常必要，有助于更方便地排查患者，控制传染源，降低医务工作者感染风险。
近20年来发生大流行的急性呼吸道病毒主要有甲型H1N1流感（2009年猪流感）、SARS（2003年）、MERS（2012年）、H7N9禽流感（2013年），及新型冠状病毒（2019年）。新型冠状病毒、SARS和MERS皆为冠状病毒，研究报道新型冠状病毒与SARS的核酸同源性达78%，与MERS的相似度达到50%[13]。三者的临床发病症状相似，主要为发热、咳嗽、呼吸困难、肌痛、乏力、胸闷、咯血、腹泻等症状。其中新型冠状病毒和SARS具有较高的相似性，病例多为普通型和轻型，传染性高（R0分别约1.4~5.5、2~5）[14]，因而SARS相关研究的参考价值较大。而MERS病程进展迅速，出现重症呼吸衰竭的比例较高（50%~89%），传播相对有限（R0<1）[15]。另外H7N9和H1N1属于流感正黏病毒科，H7N9主要引起下呼吸道症状为主的重症肺炎，致死率较高，但是其样本采集方面的研究数据较少，未纳入本文比较。2009年WHO宣布H1N1大流行为国际关注的突发公共卫生事件，以上呼吸道症状为主，较少引起严重肺损伤，传染性强（R0约1.2~1.6），致死率较低（0.03%）[16]。本节中将从采样方法、采样时间、采样安全性及便捷性3个方面评估上呼吸道采样方式，参考数据主要来自SARS、MERS、H1N1相关文献。
通过查阅文献，我们了解到SARS、MERS、H1N1这3种近年来在世界范围流行的急性呼吸道疾病引起的主要症状相类似。我们筛选出相关文献，标准为：（1）样本类型≥2种；（2）有样本检测阳性率数据；（3）总样本数>100例；（4）检测技术为RT-PCR，并进行统计和分析，以P<0.05为差异有统计学意义。常见的病毒检测呼吸道样本包括上呼吸道样本（upper respiratory tract specimen，URS）、下呼吸道样本（lower respiratory tract specimen，LRS），后者主要包括痰、TA、BAL等。多数研究显示LRS检测阳性率优于URS[17,18,19,20,21,22]，然而鉴于其取样难度较大，尤其是BAL、TA通常取于危重症插管病患，限制了其在病毒早期筛查的应用。故我们仅分析比较各URS类型检测阳性率，主要包括OPS、NS、NPS、NPA及联合取样等。
严重急性呼吸综合征（SARS）相关研究中各呼吸道样本类型的检测阳性例数（%）比较
严重急性呼吸综合征（SARS）相关研究中各呼吸道样本类型的检测阳性例数（%）比较
| 文献作者 | OPS | NS | NPS | NS+OPS | NPA | 其他URS | LRS | 检测阳性率比较 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Cheng[21] | - | - | - | - | 355/789（45.0） | 116/489（24.0） | 22/29（76.0） | LRS>NPA>其他URS |
| Chan[22] | - | - | - | 15/53（28.3） | 29/98（29.6） | - | 5/9（55.6） | LRS>NPA>NS+OPS |
| Tang[17] | 26/78（33.3） | - | 53/189（28.0） | - | - | - | 21/37（56.8） | LRS>OPS>NPS |
| Chan[18] | 13/43（30.3） | 15/58（25.9） | - | 10/25（40.0%） | 60/192（31.3） | - | 6/7（85.7） | LRS>NS+OPS>NPA>OPS>NS |
注：OPS为口咽拭子；NS为鼻拭子；NPS为鼻咽拭子；NS+OPS为联合鼻腔和口咽拭子；NPA为鼻咽吸引物；其他URS为NPA以外的上呼吸道样本；LRS为下呼吸道样本；-为无数据
在筛选的4篇SARS文献中，总计患者2 531例。4篇报道中，阳性率最高的分别是NPA（45.0%）、NPA（29.6%）、OPS（33.3%）、NS+OPS（40.0%）。综合4篇文献，我们发现在上呼吸道采样中采用NPA法采集样本的比例最高（1 079/2 096，51.2%），最少的是NS（58/2 096，2.8%）。不同取样法采集的样本其诊断阳性率差异较大（28.3%~45.0%）。Cheng等[21]比较了NPA（45.0%）和其他URS（包括OPS、NS、NS+OPS、NPS的汇总）的阳性率（24.0%），差异有统计学意义（P<0.001），NPA具有明显的优势。Chan等[22]回顾了160例患者所采样本的阳性率，比较了NPA（29.6%）和NS+OPS（28.3%）的阳性率，差异无统计学意义。这2篇文献均显示NPA法样本的检测阳性率较其他方法如NS、OPS等方法的样本检出阳性率高。而Tang等[17]研究发现，OPS（33.3%）和NPS（28.0%）之间的阳性率无差异（P=0.389）。Chan等[18]的研究中采样类型较丰富，并且选用了NS+OPS的方式，发现采用NS+OPS的标本阳性率要优于NPA（40.0% vs 31.3%），但是差异无统计学意义（P=0.379）。因此Chan等提出，相对于容易产生气溶胶增加感染风险的NPA，采用粪便样本、NS+OPS较为安全，并且检测的阳性率不低。综上所述，在SARS标本的检测中，单从上呼吸道取样方法来看，NPA法阳性率最高，NS+OPS次之。由于新型冠状病毒与SARS高度相似，我们认为NPA法作为新型冠状病毒肺炎人群取样方法作为优先推荐具有一定的临床意义。
中东呼吸综合征（MERS）相关研究中各呼吸道样本类型的检测阳性例数（%）比较
中东呼吸综合征（MERS）相关研究中各呼吸道样本类型的检测阳性例数（%）比较
| 文献作者 | OPS | NPS | NPS+OPS | NPA | LRS | 检测阳性率比较 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Huh[20] | 0/35（0） | 1/732（0.1） | 0/62（0） | - | 142/4436（3.2） | LRS>NPS>OPS |
| Lee[23] | 14/1075（1.3） | 6/3150（0.2） | 21/2240（0.9） | 0/293（0） | 204/20183（1.01） | OPS>LRS>NPS+OPS>NPS>NPA |
| Oh[25] | 29/70（41.4） | 8/70（11.4） | - | - | - | OPS>NPS |
注：OPS为口咽拭子；NPS为鼻咽拭子；NPS+OPS为联合鼻咽和口咽拭子；NPA为鼻咽吸引物；LRS为下呼吸道样本；-为无数据
我们在分析MERS所取样本检测阳性率数据时发现，LRS比例最高（76.1%），其中尤其是痰标本（74.5%）。文献高度强调LRS在筛查MERS中的必要性。而上呼吸道样本诊断阳性率非常低，如NPS仅为0.1%~11.4%，不适合作为MERS的早期筛查[19]。在Huh等[20]和Lee等[23]发表的2篇文献中，我们发现其诊断阳性的样本大部分来自于下呼吸道，为99.3%（142/143）和82.9%（204/246）。这可能与MERS的临床病理特点有关。相对于SARS，MERS患者的早、中期临床症状相似，病毒均倾向于侵犯肺叶外周及下部，但MERS的肺部病变发展得更快更重，重症患者比例明显更高。相关体内和体外实验也证实，MERS冠状病毒主要存在于远端的下呼吸道组织[24]。此深刻地提示我们，在病毒大流行时期，根据病毒的致病特点选择适当检测样本至关重要。Oh等[25]检测了17例MERS患者（9例重症和8例轻症）的OPS（41.4%）和NPS（11.4%）阳性率，发现OPS的阳性率远高于NPS（P<0.001），该项研究中较高的检测阳性率可能与病例选择相关，且病例数目也较少。
甲型H1N1流感相关研究中各呼吸道样本类型的检测阳性例数（%）比较
在H1N1样本检测的3篇相关文献中，通过分析采样数据，我们发现NS是应用最多的取样方法（33.3%），其阳性检测率为34.0%~67.6%，总体来说，相对于OPS及NPS阳性率较高。Likitnukul等[26]检测了841例流感症状患者的NS样本，显示其阳性率为51.0%。de la Tabla等[27]通过研究264例患者的配对NS+OPS和NPA采样阳性率，发现NS+OPS的检测阳性率（41.3%）高于NPA（37.1%，P=0.02)；且与NPA相比，联合采样方式取样更加容易，耗时短，被检者的接受度也更高。Suntarattiwong等[28]检测了2009年泰国H1N1流行地区418例住院患儿的配对NS和OPS，两者阳性率（34.0%比33.5%）基本一致。Wenzel等[29]对359例URS进行H1N1 RNA检测，发现NS的检测阳性率为53.3%，NPS的检测阳性率为44.8%，虽然未能比较出何者更优（P=0.277），但NS和NPS两者的检测阳性率均不低。相比新型冠状病毒肺炎，SARS、MERS鼻拭子和口咽拭子的取样阳性率较高，有可能与这2种病毒在口腔、鼻腔较富集有关。因此，病毒种类、临床主要症状等，亦是决定上呼吸道取样方法的影响因素。
综上3种类型病毒的采样方法分析，我们发现其各有特点，不同取样方法的阳性率差异较大。NPA和联合NS+OPS取样方式总体上检测阳性率较高，更为推荐，可作为新型冠状病毒肺炎推荐的上呼吸道采样方法。当然，新型冠状病毒肺炎最佳采样方法的选择，需综合评估病毒感染的病程、致病机制、病毒载量及脱落模式等多项因素，有待更多的研究支持。
我们筛选了7篇SARS文献分析采样时间对标本阳性率的影响。筛选条件为：（1）采样方法≥2种；（2）明确记录采样时间点；（3）总标本例数>100例。其中2篇文献采样时间一致（自发病起每2天一次采样）。Chan等[22]分析了NPA、NS+OPS、粪便、尿液4种样本类型检测阳性率随着采样时间（距离发病时间）的变化，另一项研究则分析了呼吸道样本（包括各种上、下呼吸道样本）、粪便/直肠拭子、尿液样本3种类型的检测阳性率[18]。对比发现，整体上样本检测阳性率峰值出现在发病后第2~3周，2项研究都显示此期间粪便样本阳性率最高（41.0%~94.0%），呼吸道（上/下）样本次之（16.0%~81.0%），尿液样本（3.0%~27.0%）最低。在病毒感染出现症状的关键时期发病第1周时，整体样本检测阳性率均较低（3.0%~50.0%），但呈上升趋势，呼吸道样本和粪便样本检测效能相似（32.0%~50.0%和10.0%~48.0%），呼吸道样本中NPA的阳性率（28.0%~48.0%）比NS+OPS（10.0%~42.0%）略高。发病3周后各样本的阳性率均呈下降趋势，仍以粪便样本检测阳性率最高，其次是呼吸道样本。
另外，Cheng等[21]研究了1 041例WHO确诊SARS病例的不同样本随着采样时间的检测阳性率变化，选用6类采样类型包括LRS、NPA、除NPA外的其他URS、粪便、尿液及血浆样本。结果显示，呼吸道样本阳性率于感染后第3~5天至第12~14天达到高峰（32.0%~100.0%），此时期内LRS检测阳性率最高（67.0%~100.0%），其次为NPA和粪便样本，然后是其他URS，最低者是血浆和尿液。发病后3~5 d内，以URS检测阳性率较高，由于症状轻，此时取LRS的患者人数较少。发病9~11 d后，总体上阳性检测率逐渐下降，此时粪便样本的检测阳性率逐渐高于URS，诊断价值较高。Hung等[30]比较了154例WHO确诊病例发病第10~15天NPA、粪便、血清、尿液4种样本类型的检测阳性率，粪便样本检测阳性率最高（87.2%），NPA次之（42.3%），再次是血清（41.5%），尿液最低（28.8%）。Poon等[31]的214例样本研究结果显示，发病10 d内，粪便检测阳性率（25.0%~68.4%）优于NPA（25.6%~60.4%）。目前在新型冠状病毒肺炎的第六版指南中，对于症状发生后何时、何部位取样尚无明确说明。综合文献，就SARS上呼吸道的样本来说，症状发生初期（2~3周内），NPA样本的检测阳性率可能较高。此期间粪便样本具有较高的阳性率，应同时重视早期粪便样本的收集。
综上所述，我们发现，整体上样本检测阳性率高峰出现在发病的第2~3周，粪便样本阳性率在整个时期均处于较高水平，尤其在第2~3周诊断价值更大。发病第1周尤其是3~5 d内，呼吸道样本的检测阳性率相对较高，其中呼吸道样本以下呼吸道较好，上呼吸道建议取NPA或NS+OPS，以提高病毒早期筛查效率。至第2~3周时，粪便样本的检测阳性率体现出明显的优势，建议同时取样。
面对传染性疾病时，医护人员作为一线救护者，存在着极大的感染风险，需增加感染性疾病的自我防护意识。就上呼吸道取样方法的医护人员安全性而言，NS、MTS、OPS较为安全，患者不适感较低，操作简便，耗时少；NPS、NPA、痰液等在取样过程中存在诱发咳嗽、喷嚏及产生气溶胶可能，增加病毒传播及医护人员的感染风险。从采样便捷性的角度出发，NS、MTS、OPS、痰液所需材料均较简单，操作容易，而NPA的采集需抽吸装置和专业培训。NPS虽材料简单，但因解剖位置较深、取样操作规范与否对样本质量影响较大，因此与NPA取样法相同，取样人员均需接受耳鼻咽喉科专业培训。另外，值得一提的是，MTS采样所用的植绒拭子设计了取样深度的塑环标记，方便患者自行收集样本，一方面可以减少医护人员的感染风险，另一方面对于儿童来说由父母收集样本其配合程度亦较高。Larios等[32]通过对76例配对样本进行多种急性呼吸道传染病毒（包括冠状病毒、鼻病毒等）检测发现，患者自行收集的MTS与耳鼻咽喉专业医护人员收集的NPS其病毒检测敏感度相似。
由于新型冠状病毒的不可预见性、传播性强、危害性大等因素，已给全国甚至全球民众的健康和经济带来了巨大危害。早期筛查、隔离、治疗是新型冠状病毒肺炎防控的关键，核酸RT-PCR检测样本阳性是诊断的金标准。由于上呼吸道取样方法是最便捷、患者舒适程度相对最高的取样方式，我们因此综述了SARS、MERS、H1N1 3种病毒的上呼吸道取样方法、取样时间对核酸检测成功率的影响因素，分析了不同取样方式对医护人员自身安全的威胁程度，试图根据以往的经验来为目前感染人员上呼吸道取样的选择问题提供借鉴和参考。
通过文献分析，各国虽都很快针对新型冠状病毒肺炎发表了诊疗指南，但在病毒样本取样方式上，无优先推荐级别，亦无随着发病时间变化特异性的取样方法。综合收集的文献，从上呼吸道取样方法来说，NPA是采用率最高的上呼吸道取样方式，其核酸阳性率高于中国最新指南推荐的NPS。从取样时间来看，NPA在症状出现后的2周左右处于核酸阳性率较高水平，与粪便样本的阳性率不分伯仲；但超过2周后，NPA的阳性率开始下降，此时粪便样品检测的优势开始体现。从医护人员自身防护的角度考虑，NPA法有引起患者打喷嚏、咳嗽致气溶胶产生的风险、取样时间偏长、需专业培训、交叉感染风险高等缺点。基于此种忧虑，更加温和而又能保证检测阳性率的取样方法如NS+OPS、以及粪便样本的留取可能更值得优先推荐。
所有作者均声明不存在利益冲突
