乳腺癌治疗过程中产生的治疗耐受已经成为其复发和转移的主要原因，耐受机制可能与激活DNA损伤应答反应有关。为了保持细胞基因的完整性，DNA损伤应答通路有较为复杂的信号转导通路系统，其中包括细胞周期监测点、DNA修复、转录和细胞凋亡。在癌症治疗中，各种细胞毒性药物以及放疗导致的基因损伤可以诱发DNA的损伤应答，对损伤反应的应答修复功能限制了放化疗的疗效。因此，为了提高乳腺癌放化疗的敏感性，满足找准靶向治疗药物的迫切需要，有必要将DNA损伤应答通路作为靶点治疗的机制研究，特别是对细胞周期监测点激酶1 (CHK1)功能抑制药物的研究。最新的观点认为CHK1是DNA损伤应答激活的主要标志物，表明CHK1不仅激活了细胞周期检查位点的调节，而且直接影响了DNA修复和细胞凋亡。因此CHK1在DNA损伤应答机制中的作用能够促进CHK1抑制剂成为放化疗耐受肿瘤患者的一种新的治疗手段。
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乳腺癌是威胁女性健康的最主要癌症之一，也是因癌症而死亡的最常见的原因之一[1]。放化疗是乳腺癌的标准治疗方案，已证明其能提高患者的总生存率[2,3]。尽管目前已经持续对放化疗进行了改良和发展，但是乳腺癌复发和治疗耐受仍然呈现较高的发生率[4]，成为乳腺癌治疗的挑战。放疗主要是针对抑制DNA损伤应答通路发挥作用，因此对肿瘤进行放射治疗后，肿瘤细胞的DNA损伤应答通路不能有效修复损伤的DNA，导致DNA损伤后的感应器多蛋白复合物激活近端转换器ATM (ataxia-telangiectasia mutated gene)、ATR (ATM and rad3-related gene)，进而激活磷酸化远端转换器，包括丝氨酸／苏氨酸激酶细胞周期监测点激酶1(checkpoint kinase 1， CHK1)[5]，从而导致细胞死亡。然而，放疗同时也会产生其他问题，包括基因组的不稳定性、旁观者效应[6]、放疗耐受等。一旦DNA损伤修复应答通路被激活，一系列复杂的检查位点即被识别[7]，通过一系列的DNA损伤应答蛋白进行调节，当这些蛋白被激活就会导致细胞周期的停滞，进而有效地进行DNA修复，避免未修复的损伤DNA直接进入复制期及有丝分裂期而发生细胞凋亡或突变[5,8]。癌细胞通过完善的DNA损伤应答通路有效避免了放疗产生的DNA损伤，但是产生了放疗耐受。因此避免或针对性的治疗乳腺癌放化疗过程中产生的治疗耐受对于当前乳腺癌的治疗，以及由乳腺癌推广至所有癌症疗效的提高仍是一个巨大的挑战。
已有试验证明，参与激活CHK1和CHK2并使其大量磷酸化的检查点效应包括细胞周期的延迟[9]、DNA损伤修复[10]，若未修复会诱导细胞凋亡以及染色质重组。因此，本综述主要针对检查点信号通路的新观点，尤其对CHK1在其中的作用进行了总结。
DNA损伤应答通路是一个含有多种通路的信号网，包括细胞周期监测点、DNA修复、转录调节和凋亡[11]。多种内源性及外源性损伤，如电离辐射、基因毒性药物都会引起DNA的损伤[12]，DNA损伤包括单链损伤、双链损伤、化学加合物以及不匹配[13]。当损伤发生时，不同的相交或联合的检查点被激活，从而阻止细胞进入S期(G1/S期的检查点)，延迟S期进展(S期检查点)，或阻止有丝分裂(G2/M期检查点)[14]。这些靶点的激活通过修复特定的基因转录形成不同的修复机制，如碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、同源重组或者非同源重组(NHEJ)。DNA双链损伤的修复在G1期主要通过非同源重组修复，在S及G2期则主要是通过同源重组进行修复[13]。
检查点信号通路由感受器、中枢、传递器以及下游的效应器组成[12]。DNA损伤后，多蛋白混合物形成的感受器识别损伤，在损伤处集聚并激活近端传感器，如ATM和ATR。ATR和ATM转导信号至远端传感器检查点激酶(如CHK1及CHK2)。尽管ATR和ATM之间作用有重叠，但一般ATM激活CHK2，而ATR则主要激活CHK1。
活化的ATR/ATM和ATM/ATR调节的磷酸化感受器使得调节器(如53BP1、BRAC1、MDC1、SMC1、FANCD2、 Claspin、TopBP1、Timeless、Tipin、H2A.X等)聚集并且磷酸化。一旦调节器被激活，便聚集在损伤部位，从而释放CHK1或CHK2，激活可溶性的靶点。活化的调节器可以促进ATR/ATM诱导的CHK1/CHK2的活性。
激活"远端传感器"的磷酸化以及促进降解及螯合效应点Cdc25s，通过特定的抑制位点(Tyr15和Thr14)的脱磷酸作用，特异性的磷酸酶可以激活周期素依赖性蛋白激酶(如Cdk1/Cdc2和Cdk2)。CHK1/CHK2和ATM/ATR同样可以磷酸化效应器p53，增加其稳定性。Cdc25的失活以及p53的聚集可以使细胞周期终止在特定的阶段。
CHK2通过ATM调节其激活，但是受ATM激活的CHK2主要出现于DNA双链断裂的时候。CHK1的激活是由ATM及ATR调节的多种损伤因素(如紫外线、复制压力、DNA损伤药物)诱导的，一般来说，CHK1激活主要开始于DNA单链断裂。
在DNA复制期间基因特别脆弱。在S期，内源性或外源性的损伤阻碍复制叉的进展，导致了复制叉的停滞，进而使其不稳定且易破碎。当复制叉受到损伤，DNA聚合酶位点出现解旋酶，导致DNA双链解旋而出现大量的单链DNA。DNA单链断裂之后，表面结合复制蛋白RPA通过ATRIP识别和链接RPA-ssDNA募集ATR-ATR相关蛋白(ATRIP)复合物。ATR-ATRIP的激活需要Rad17/9-1-1复合物的集聚，这也是ATR调节CHK1活性所必需的。
DNA双链损伤后，MRN复合物MRE11-Rad50-Nbs1和DNA双链损伤相互作用，激活ATM，诱导CHK2激活。MRN及ATR同样调节DNA双链损伤的切除，导致DNA单链损伤形成作为DNA修复的中间结构，通过RPA-ATR-ATRIP的修饰缓慢激活CHK1。
激活ATM/ATR以及感受器蛋白使CHK1/CHK2在损伤处聚集随后被激活。CHK1和CHK2是结构不同的激酶，并且通过不同的机制被激活。ATM主要在Thr68这个位点被磷酸化，通过反向自磷酸化在Thr383/387位点促进同源二聚化和激活。相反CHK1的激活并不需要二聚化及反向自磷酸化作用， ATR(主要)或ATR(小部分)在Ser317/345使CHK1磷酸化，直接导致其激活。ATR激活CHK1还需要通过Rad17-RFC复合物及一些基本的调停物来加载9-1-1复合物(Rad9-Hus1-Rad1)。如Claspin直接与CHK1结合并增加两者的稳定性。 Claspin磷酸化作用促进BRCA1蓄积及磷酸化作用，然后使CHK1和ATR聚集增多。TopBP1直接激活ATR-ATRIP并促进ATR调节的CHK1磷酸化[18]。Timeless (Tim/Tim1)和Tipin通过使Tipin结合到RPA上来形成染色体有关的稳定复合物，是染色体相关Claspin和CHK1在S317/s345位点磷酸化的关键。
最近，有两个激活CHK1的模型：(1)在C端的磷酸化作用位点(如S317/345)阻止分子内的相互作用，但并不包括N段的激酶区间[19]；(2) S317/345磷酸化导致非活化的CHK1从染色体释放而聚集于中央体，从而阻止Cdk1的激活，进而阻止细胞进入有丝分裂期[20]。值得注意的是，尽管S345对于激酶的激活和功能至关重要，但S317仅起辅助作用[21]。然而不同的磷酸化位点起着不同的作用，S345是细胞存活所必需的，而S317对靶点的激活则并非必需。
DNA损伤靶点通常有2个调节通路[22]：ATR/ATM-CHK1/CHK2-Cdc25s通路(快速、可逆)以及p53独立通路(缓慢、不可逆)。
在S期检查点至少包括两个通路，ATM/ATR-CHK1/CHK2-Cdc25A-Cdk2通路以及Nbs1独立通路(包括ATM/Nbs1/Smc1以及ATM/Nbs1/FANCD2的独立通路)[23]。通过ATR激活的CHK1在复制压力应答中起着重要作用(复制检查点)，而且CHK1直接磷酸化对于S期的各种激酶(Cdc7和Tlk1)都是必需的。Cdc7磷酸化(激活)对于通过MCM2-7复合物和Cdk2有效地调节Cdc45加载到复制起源而引发DNA复制是非常重要的[24]。此外，当DNA复制停滞时，活化的CHK1限制了复制叉的进展，并且对于抑制信使RNA扩增p53目的基因是必需的[25]。
最近报道CHK1是通过泛素化蛋白PCNA来调节DNA的合成和翻译的[26]。然而ATR/CHK1对于稳定复制叉压力至关重要，DNA翻译使得复制叉能够通过有DNA损伤的位点。对于已损伤的DNA复制及避免复制叉破裂来说，CHK1都起着重要的作用。
Cdk1/cdc2调节有丝分裂的起止。Cdk1/cdc2的激活涉及Tyr15/Thr14的脱磷酸化，通过Wee1和Myt1调节磷酸化以及Cdc25C调节脱磷酸化实现。Cdc25A可能涉及在G2/M期靶点Cdk1的去磷酸化作用。Chk1是Cdc25A (Ser76/124)和Cdc25C (Ser216)磷酸化的重要激酶，导致Cdc25A泛素化(通过泛素连接酶APC/C和Skp1/Cullin/F-box proteins/SCF实现)以及蛋白酶体降解；对于Cdc25C则通过结合到14-3-3蛋白(Rad24和Rad25)导致核输出及胞质封存。CHK1同样可以使另一个在调节细胞周期中起关键作用的Wee1检查点进行磷酸化，并且保持其稳定性[28]。为了维持G2/M期的停滞，需要Cdk/cyclinB复合物处于未激活状态，这就需要通过p53依赖性机制及p53非依赖性(如通过BRCA1途径)机制转录诱导内源性Cdk抑制物(如p51、14-3-3等)来实现。这一过程同样有CHK1的参与。
Cdk2-cyclin E/A的失活是通过Cdc25A调节去磷酸化(如Tyr15/Thr14)(快速、可逆)或者由p53诱导p21(慢速、持续)完成的，引起G1期阻滞并抑制损伤进入S期。
在伴有有丝分裂轴缺陷的细胞中，有丝分裂纺锤体检查点延迟到后期出现。因暴露于有丝分裂的毒性药物(如紫杉醇)在有丝分裂之前着丝点聚集CHK1并且使其在非正常位点磷酸化，使AuroraB磷酸化并且提高了其催化活性。其反过来调节着丝点上BubR1的磷酸化[30]，聚集更多的有丝分裂检查点，使得错误的有丝分裂中止，进而有充足的时间进行修复。抑制CHK1会诱导多种有丝分裂缺陷，且使Aurora B错误定位[31]。另外，CHK1反向调节另一个重要的有丝分裂基底物Plk1[32]。
CHK1通过靶向修复酶(如DNA-PK)和Ku70-K80(设计DNA-PK复合物)一同参与DNA修复，这对于DNA双链损伤修复非常重要[33]。此外，依赖CHK1的Rad51磷酸化对于DNA损伤诱导的同源重组修复非常重要[10]。最后，CHK1调节的FANCE磷酸化对于范可尼贫血(FA)以及BRCA调节的DNA修复通路至关重要[34,35]。相反，通过抑制剂或siRNA抑制CHK1会引起DNA单链损伤形成以及DNA链断裂[36]。
p53是负责凋亡应答的主要下游检查点的信号蛋白。 ATR/CHK1信号对于复制压力导致的抑制半胱天冬酶3(Caspase 3)依赖的细胞凋亡应答至关重要[37]。此外，CHK1同样阻断Caspase 2依赖的凋亡应答[38]。有趣的是，Caspase调节CHK1断裂(Asp299/Asp351)而促进其活化，直接连接了CHK1以及凋亡信号。
CHK1磷酸化组蛋白H3 (Thr11)的作用是阻遏DNA损伤诱导的细胞周期调节基因(如cyclin B1和Cdk1)的转录功能，此过程是通过减少组蛋白乙酰化的作用实现的[39]。
近端(ATM/ATR)和远端(CHK1/CHK2)转换器组成了DNA双链损伤信号网络的核心。从理论上讲，抑制其中的任何一个都可以提高放化疗的疗效。目前并没有发现ATR特异性抑制剂。ATM理论上是合适的，但ATM抑制剂[KU-55933和KU-60019(35)；Kudos]仍然处于临床前期阶段。因此，无论是ATM还是ATR，或是两者联合，都是值得探究的有效靶向治疗方案。除了磷酸化基底物相似之外，CHK1和CHK2在细胞存活及检查点调节中的作用明显不同。CHK2的作用主要依赖不同阶段及细胞亚型，一般限制于双链损伤诱导的检查点。CHK1涉及的检查点调节涉及多种损伤刺激(如紫外线以及各种DNA损伤药物)以及DNA复制压力(甚至在静止细胞中)，因此CHK1对于由多种因素导致的损伤是一个极具吸引力的靶点：(1) CHK1与所有的检查点有关(G2/M、G1/S、S期以及最近发现的有丝分裂纺锤体检查位点)；(2)对于维持基因组的稳定性必不可少；(3) CHK2的作用在某种程度上可以被CHK1或其他激酶取代，但是CHK1的作用并不能被其他激酶取代；(4)CHK1在DNA复制检查点起重要作用；(5) CHK1参与其他重要功能(如DNA修复以及细胞凋亡抑制)。因此，在DNA损伤应答通路中，CHK1起主要作用，而CHK2只是辅助其他激酶发挥作用[8]。因此，认为CHK1可以用来作为针对DNA损伤通路治疗的癌症新靶点。
AZD7762 (AstraZeneca)：强效、非特异性CHK1抑制剂；结合于CHK1的ATP结合位点，在体外抑制CHK1调节的Cdc25C链接肽的磷酸化(IC50=5 nmol/L)[40]。
LY2603618 (Lilly)：通过与CHK1结合并且限制CHK1活性从而干扰DNA修复，增加各种化疗药的疗效[41]。前期临床试验尚未发表。
CBP501(CanBas)：非特异性CHK1抑制剂，在体外通过Cdc25C相应的肽aa211-221抑制CHK1(IC50=3.4 μmol/L)和CHK2(IC50=6.5 μmol/L)。
PF-00477736 (Pfizer)：强效选择性，ATP竞争性CHK1抑制剂，来源于PF-00394691，体外抑制CHK1(Ki=0.49 nmol/L)及CHK2(Ki=47 nmol/L)。抑制了G2/M(喜树碱类)和S期(吉西他滨)的检查位点[42]。在体内及体外实验中通过联合降低Cdc25C细胞质磷酸化(Ser216)以及组蛋白H3磷酸化(Ser10)明显提高了多西他赛的疗效[43]。
SCH-900776 (Schering-Plough)：该复合物选择性结合并且抑制CHK1，抑制S期及G2/M期检查点，从而使肿瘤细胞对放疗及烷化剂敏感。
XL844 (Exelixis)：强效ATP竞争性抑制剂，抑制CHK1(Ki=2.2 nmol/L)和CHK2(Ki=0.07 nmol/L)[44]。
CEP-3891(Cephalon)：抑制由放疗诱导的G2/M及S期检查点[45]。并且同样可以通过隔离缺陷染色体使放疗诱导的有丝分裂的核分裂加速，使杀伤力增强[46]。
CHIR-124 (Chiron)：强效，选择性CHK1抑制剂，占据ATP结合位点，抑制CHK1 (IC50=0.3 nmol/L)的能力是CHK2 (IC50=0.7 μmol/L)的2 000倍。
PD-321852(Pfizer)：CHK1调节的Rad51对吉西他滨诱导的复制压力应答可使化疗变得敏感[47]，仍在临床前期研究中。
MK-1775(Merck)：是Wee1抑制剂(IC50=5.2 nmol/L)，在体内及体外加强DNA损伤药物活性(如吉西他滨、卡铂、顺铂)，特别是p53阴性的癌症[48,49]。
PD0166285 (Pfizer)：强效，Wee1 (IC50=24 nmol/L)和Myt1(IC50=72 nmol/L)的临床前期抑制剂，在抑制位点(Tyr15/Thr14)抑制Cdk1 /cdc2磷酸化，并不依赖p53状态。废除放疗诱导的G2/M期检查点，并且提高p53依赖性的细胞死亡[50]。另外，其同样稳定微管及细胞下调素D[51]。
综上所述，在DNA损伤应答中，CHK1靶点的激活可以保护复制压力，稳定停滞的复制叉，控制新生复制点激活，调节同源重组以及控制细胞周期进展，进而可以使治疗后导致DNA损伤的癌细胞得到修复，从而导致放化疗耐受。鉴于DNA损伤修复应答和细胞周期停滞、同源重组、复制压力之间的相互联系，若抑制CHK1的激活，可使癌细胞损伤的DNA得不到修复而诱发细胞凋亡，进而控制癌症的复发和转移，所以可以考虑将CHK1抑制剂作为治疗恶性肿瘤的新药物。
无
