探讨耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验(ATP-TCA)对肺鳞状细胞癌二线化疗的指导意义，为临床治疗提供参考。
收集组织病理学或细胞学确诊的、行NP方案一线化疗出现病情进展的肺鳞状细胞癌患者150例，采用实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)行耐药基因切除修复交叉互补基因1(ERCC1) mRNA、核苷酸还原酶M1亚基(RRM1) mRNA检测及ATP-TCA。两种方法检测结果同时显示对吉西他滨+顺铂(GP)化疗方案敏感者，行二线GP方案全身化疗(GP组)；两种方法检测结果同时显示对GP方案不敏感或结果不一致者，采用二线多西他赛+顺铂(DP)化疗方案(DP组)，两组均行2~4个周期全身化疗。随访胸部CT，观察化疗有效率、中位无进展生存(PFS)及中位生存期。
GP组有效率为36.2 %(17/47)，DP组为28.1 %(26/92)，两组差异有统计学意义(χ2= 4.274，P<0.05)；GP组与DP组中位PFS时间分别为4.2个月(95 % CI 3.485~ 5.348个月)和3.6个月(95 % CI 2.685~ 4.648个月)，差异有统计学意义(P<0.05)；GP组与DP组中位生存期分别为9.6个月(95 % CI 8.283~ 10.637个月)和8.9个月(95 % CI 7.384~9.648个月)，差异无统计学意义(P> 0.05)。
耐药基因检测联合ATP-TCA对于晚期肺鳞状细癌二线化疗方案的选择有一定的指导意义。
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肺癌患者在确诊时大多属于晚期，放、化疗对于占肺癌80％的非小细胞肺癌的疗效已达瓶颈[1]。与肺癌相关的小分子靶向治疗药物在肺鳞状细胞癌面前显得束手无策[2]，如何为肺鳞状细胞癌患者筛选出最佳的化疗方案是治疗的关键。本研究采用耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验(adenosine triphosphate-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA)指导肺鳞状细胞癌二线化疗敏感药物的选择，以期减少化疗的盲目性、随机性，提高化疗有效率。
收集山西省肿瘤医院呼吸一科2012年8月至2014年8月经组织病理学或细胞学确诊为肺鳞状细胞癌的患者150例，其中男性98例，女性52例；年龄28~ 70岁，中位年龄61岁；TNM分期为ⅢB～Ⅳ期。既往曾接受2~ 6个周期的长春瑞滨联合顺铂或卡铂方案的姑息性全身化疗，中位化疗4个周期。所有患者复查胸部CT确认疾病进展的时间距末次化疗>3个月，美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分≤2分，预计生存期>3个月。入选患者从皮下转移结节、浅表转移性淋巴结、恶性胸腔积液或经气管镜下活组织检查、灌洗、纵隔淋巴结针吸等取得组织病理小标本，确诊为癌组织后行耐药基因切除修复交叉互补基因1(ERCC1)mRNA、核苷酸还原酶M1亚基(RRM1) mRNA检测及针对吉西他滨联合顺铂(GP)方案的ATP-TCA。两种方法检测结果同时显示对GP方案敏感者，采用二线GP方案(吉西他滨1 250 mg/m2，第1、8天，顺铂30 mg/m2，第1天至第4天)全身化疗(GP组)；两种方法检测结果显示对GP方案不敏感或结果不一致者，采用二线多西他赛+顺铂(DP)方案(多西他赛75 mg/m2，第1天，顺铂30 mg/m2，第1天至第4天)全身化疗(DP组)，两组均行2~4个周期全身化疗。治疗前患者血常规、心电图、肝肾功能等各项检查指标正常，告知患者化疗的相关风险及可能获益，所有患者均签署知情同意书。
GLOMA荧光测定仪(美国Turner Bio Systems公司)、紫外分光光度仪(德国Eppendorf公司)、 ATP-TCA检测试剂盒(北京金紫晶生物医药)、荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、RNA提取试剂盒及基因表达相对定量检测试剂盒(厦门艾德生物科技)。使用药物：国产吉西他滨(哈尔滨誉衡药业)及顺铂(山东齐鲁药业)。
患者的活组织检查标本分为3份，分别进行病理检查、ATP-TCA及耐药基因检测。病理检查明确为癌组织后，严格按试剂盒说明书操作步骤行ATP-TCA。RRM1、ERCC1 mRNA检测：按试剂盒说明书提取RNA，用紫外分光光度计测定基因组RNA浓度，A260/A280比值介于1.8~ 2.0之间，A260/A230比值≥1.7，符合纯度要求。采用实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)联合Taqman荧光探针检测耐药基因ERCC1、 RRM1 mRNA的表达。
ATP-TCA结果判定：参照Kurbacher等[3]1998年制定的标准，分为高度敏感、中度敏感、轻度敏感、耐药，高度及中度敏感者视为敏感。
耐药基因检测结果判定标准：根据试剂盒说明书中4条曲线(阴性质控品、阳性质控品、校准质控品、样本)评判标准进行判读，依据公式计算检测结果的cut-off值(M)，最后行结果分析。ERCC1：低表达区间(顺铂敏感)M≤0.690；中表达区间(顺铂部分敏感) M>0.690，且<2.376；高表达区间(顺铂耐药)M≥ 2.376。RRM1：低表达区间(吉西他滨敏感)M≤ 0.047；中表达区间(吉西他滨部分敏感)M>0.047，且<0.120；高表达区间(吉西他滨耐药)M≥0.120。敏感和部分敏感均视为敏感。
M=2-b
b=(Ct样本ERCC1/RRM1基因-Ct样本内参基因)-(Ct校准ERCC1/RRM1基因-Ct校准内参基因)
采用美国癌症研究所制定的NCI-RECIST实体瘤疗效评价标准，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)及进展(PD)。以CR+PR计算客观有效率(RR)。无进展生存(PFS)时间为二线治疗开始至有客观证据表明疾病进展或患者死亡的时间。中位生存期(MST)为当累积生存率为50％时所对应的生存时间。
用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，率的比较用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
150例患者中，5例患者病理检查为慢性炎性组织；3例患者未发现癌细胞；在行耐药基因检测中，3例患者RNA提取不满意，未行检测。标本的可评估率为92.7 %(139/150)。
139例患者进行了ATP-TCA和ERCC1 mRNA、 RRM1 mRNA检测，通过ATP-TCA筛选出58例患者对GP方案敏感，其中耐药基因检测显示47例患者ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA低表达，对GP方案敏感；另外11例患者ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA高表达，对GP方案不敏感。两种方法的符合率为81.0 %(47/58)。GP组47例患者的有效率为36.2 %(17/47)，DP组92例患者的有效率为28.1 % (26/92)，两组间有效率差异有统计学意义(χ2= 4.274，P<0.05)(表1)。
耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验不同检测结果肺鳞状细胞癌患者二线化疗效果
耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验不同检测结果肺鳞状细胞癌患者二线化疗效果
| 组别 | 例数 | 完全缓解(例） | 部分缓解(例） | 稳定(例） | 进展(例） | 有效率(%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| GP组 | 47 | 0 | 17 | 16 | 14 | 36.2 |
| DP组 | 92 | 0 | 26 | 31 | 35 | 28.1 |
注：GP组为两种方法检测结果同时显示对GP方案敏感者，行二线GP方案全身化疗；DP组为两种方法检测结果同时显示对GP方案不敏感或结果不一致者，采用二线DP方案全身化疗
对139例患者随访1年，其中失访9例(GP组4例， DP组5例)，生存45例(GP组16例，DP组29例)。GP组和DP组的中位PFS时间分别为4.2个月(95 % CI 3.485~ 5.348个月)和3.6个月(95% CI2.685~ 4.648个月)，两组间差异有统计学意义(P< 0.05)(图1)；GP组和DP组的MST分别为9.6个月(95 % CI 8.283~10.637个月)和8.9个月(95 % CI 7.384~ 9.648个月)，两组间差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。
GP组为两种方法检测结果同时显示对GP方案敏感者，行二线GP方案全身化疗；DP组为两种方法检测结果同时显示对GP方案不敏感或结果不一致者，采用二线DP方案全身化疗
目前，晚期肺鳞状细胞癌的标准治疗仍是细胞毒性药物，一线治疗有效率在40％左右[4]，二线治疗疗效各报道不同，有效率低于一线治疗[5]。肺鳞状细胞癌患者在经历了一线及二线化疗以后可供选择的化疗药物较少，通过药敏试验及基因检测为患者选择有效的化疗药物，可以提高化疗有效率，减少盲目性。
肺癌的化疗通常采用以铂类药物为基础的治疗方案，主要包括顺铂、卡铂、奈达铂等，通过形成铂-DNA加合物发挥细胞毒性作用。DNA基因修复主要是由核苷酸切除修复(NER)和链间交联完成的，而ERCC1是参与NER过程的关键因子，ERCC1的过表达可使停滞在G2/M期细胞中损伤的DNA得到迅速修复，导致其对顺铂耐药。多项关于ERCC1 mRNA表达水平与化疗疗效、预后相关性研究的结果并不一致。有研究显示ERCC1 mRNA的低水平表达与化疗疗效增加、生存时间延长相关，而高表达则与顺铂诱导的DNA加合物清除增加及顺铂耐药相关[6]。有研究认为ERCC1的表达水平可以预测化疗疗效[7]。Vassalou等[8]用免疫组织化学方法检测ERCC1蛋白的表达，低表达者疾病控制良好，其TTP、OS较长，但与铂类化疗疗效无关。Ozdemir等[9]通过免疫组织化学方法得出无论ERCC1低表达或高表达，其与化疗疗效或生存时间无关。研究者持有不同的观点可能与用于检测ERCC1基因的肿瘤组织不同及采取的测定方法不同有关。
RRM1与吉西他滨耐药有关，核苷酸还原酶是RNA合成的前提，包括RRM1和RRM2，它能使核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，后者是DNA合成和修复所必需的。RRM1通过控制酶的活性，还可与吉西他滨结合后干扰核苷酸还原酶的功能，导致吉西他滨耐药。多项研究结果显示吉西他滨疗效与RRM1 mRNA的表达呈负相关，提示吉西他滨对RRM1 mRNA低表达者疗效好，高表达者疗效差[10,11,12]。
ATP-TCA是一种测定细胞内ATP含量的技术。在有氧环境下，荧光酶催化荧光素释放出波长为562 nm的荧光，同时ATP转变成AMP。所释放的荧光强度与胞内ATP含量呈正相关。活细胞的ATP含量基本恒定，但是细胞死亡之后，细胞内ATP会迅速水解。因此可以通过测得的荧光强度反映细胞内ATP含量，进而反映活细胞的数量。参照相应判断指标，比较药物系列浓度对培养细胞的不同抑制率，便可以评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤功效。王静等[13]利用ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术，在治疗非小细胞肺癌胸腔积液的过程中，发现依据药敏试验结果选择化疗方案获得的临床收益要明显高于经验性选择用药，提示采用ATP-TCA指导化疗比经验性给予标准化疗方案具有更好的疗效。
赵丹等[14]通过收集原发性卵巢癌患者肿瘤减灭术后标本，采用RT-PCR方法检测耐药基因ERCC1、 BRCA1 mRNA水平，同时行体外ATP-TCA，结果发现ERCC1 mRNA、BRCA1 mRNA的表达量在预测体外化疗方案敏感性时有意义，而ATP-TCA不仅可以预测化疗方案的敏感性，还可以预测复发和预后的影响因素。赵美琴和王红兵[15]收集了非小细胞肺癌新鲜手术标本，采用免疫组织化学方法检测BRCA1、 ERCC1、RRM1蛋白表达水平和紫杉醇、顺铂、吉西他滨体外药物敏感性的相关性，结果显示两种方法结合具有临床指导意义。但由于肿瘤具有异质性、分化不均以及多态性的特性，导致同样两种方法检测结果存在差异，对此种结果我们根据美国国立综合癌症网络(NCCN)指南选择标准二线化疗方案。
对于晚期非小细胞肺癌，ECOG1594研究中4种第三代含铂两药化疗方案疗效差异无统计学意义[16]，三代含铂两药化疗方案成为非小细胞肺癌一线标准治疗方案。JMDB研究的亚组分析显示，肺鳞状细胞癌患者采用吉西他滨联合顺铂的疗效优于培美曲塞二钠联合顺铂方案[17]。本研究GP组的有效率为36.2 %，DP组为28.1 %，两组差异有统计学意义(P<0.05)，GP组的PFS时间为4.2个月，DP组为3.6个月，两组差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，同样为肺鳞状细胞癌患者，在根据病理类型选择化疗方案的同时，应该认识到患者在遗传、基因表达等方面的异质性，也验证了ECOG1594研究中的发现，即GP方案在降低疾病进展的风险方面有突出优势[14]。本研究GP组MST为9.6个月，DP组为8.9个月，两组差异无统计学意义(P>0.05)，与其他研究结果相一致[14]，提示需要结合病理类型、分子生物学标志等指标，以指导临床进行个体化治疗。
无
