循环肿瘤细胞（CTC）是一种自发或因手术、穿刺等引起的从肿瘤病灶脱落入血的恶性肿瘤细胞。近年来，随着对CTC研究的不断深入，其检测方法也逐渐多样化。临床上，CTC作为新兴的生物学标志物，在肿瘤的诊断、疗效监测和预后评估中起着非常重要的作用。文章介绍了目前CTC富集和分析技术，并阐述CTC与肿瘤之间的关系。
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肿瘤是一种由多因素引起的严重危害人类健康的疾病。肿瘤的发病率逐年上升，且呈现发病年龄逐渐年轻化、病理类型多样化等特点。遗传、免疫功能缺陷以及生物、物理、化学等因素均可引起肿瘤。肿瘤转移是引起死亡的主要原因[1]。目前，肿瘤患者主要通过临床症状、影像学或生物学标志物等方法进行诊断。早期发现肿瘤，其治愈率可达80%以上。但早期肿瘤往往没有明显的临床表现，患者就诊时一般都已进入中晚期阶段，此时大部分肿瘤已发生转移。因此，肿瘤的早期诊断和转移监测就显得尤为重要。
CTC是一种来源于实体瘤的肿瘤细胞，存在于患者的外周血中[1,2]，由Ashworth[3]于1869年首先提出。当CTC从原发病灶脱落后，大部分会被机体的免疫细胞识别、吞噬，但仍有一些具有高存活率和迁移性的CTC能够避开机体免疫细胞的杀伤作用，随着循环系统到达远端组织，形成肿瘤转移灶。
作为转移的导向指标，CTC对于判断原发性和继发性肿瘤有非常重要的作用[4,5]。大量研究表明，肿瘤患者CTC可以作为早期诊断、监测治疗、预测复发的标志物[6,7]。CTC在肿瘤发生的早期阶段，甚至在恶变前阶段，可能已存在于外周血液中。文献[8]报道肿瘤患者每7.5 ml外周血液中CTC的数量超过5个，患者的生存率较低。同时CTC作为一种液体活检，具有方便、简洁的特点，可在一定程度上减轻患者在做其他检查时引起的创伤和人为造成肿瘤转移的可能[9]。然而外周血液中CTC的数量十分稀少[10]，每1 ml外周血液中（约5×1010红细胞、7×106白细胞）仅有几个CTC[11]。因此，CTC的检测成为其临床推广应用的障碍之一。
近年来，随着CTC研究的不断深入，其检测方法也越来越多样化。CTC的检测主要分为富集技术和分析技术两部分。目前，较为经典的富集方法主要有密度梯度离心法、抗体依赖分离法、基于尺寸分离法三类；分析技术主要有免疫化学分析法和核酸分析法两种。随着对检测方法研究的不断深入，微流控芯片技术被逐渐运用到CTC的检测中，它将细胞的捕获和鉴定集于一体，在CTC的基础和临床研究中占有一席之地。
密度梯度离心法主要根据细胞种类和沉降系数不同的原理实现细胞分离。通过梯度离心，可将单个核细胞从红细胞、血小板、多形核细胞中分离出来。目前密度梯度离心法主要有Ficoll法和OncoQuick Plus法两种，由于密度梯度离心法可能导致肿瘤细胞的损失率较高，现一般只用于其他富集方法的前处理。
抗体依赖分离法主要分为阳性富集和阴性富集。CellSearch系统是一种经典的阳性富集方法，也是唯一被美国食品药物监督管理局（FDA）批准进入临床的CTC检测方法。其核心原理是将上皮细胞黏附因子（EpCAM）和细胞角蛋白（CK）作为检测标志物。该系统利用抗体磁珠-纳米颗粒，偶联上皮细胞表面标志物EpCAM，结合肿瘤细胞表面抗原，通过荧光（CK8、CK18、CK19）标记抗体，并对核染色以识别CTC。一般CTC经过荧光染色后CD45表达为阴性，CK表达为阳性，并有完整的细胞形态。用CellSearch系统检测时，当CTC计数≥2个/ml时，判定为阳性。当然，阳性富集法也存在很多不足，并非所有的肿瘤细胞均表达EpCAM。文献[12]报道，在134例不同组织学肿瘤细胞中，只有70%的肿瘤细胞表达EpCAM，并且细胞表面标志物在细胞系中会有缺失，引起低富集率。
阴性富集是不依赖于CTC表面标志物进行的一种方法。富集时先除去全血中其他非肿瘤细胞，再富集肿瘤细胞。常用的梯度法例如Ficoll法先去除红细胞，再利用CD45标记去除白细胞，最后通过免疫化学分析法或者反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的应用来验证CTC。同样阴性富集也存在很多不足，它不能识别富集到的所有异常细胞，同时过多的白细胞会干扰CTC的识别，而且CK阳性的细胞其CD45也可为阳性[13]。
CTC的直径一般大于正常细胞，因此可以通过基于孔径大小的膜过滤法富集CTC。具有较好的灵敏性和特异性，而且其操作简便、快速，成本也较低。
膜过滤分离循环肿瘤细胞技术（ISET），是该方法的代表[14]。滤过孔径为8 μm，用聚碳酸酯制作的膜过滤器过滤患者的血液标本，体积较小的细胞如红细胞等被滤过，而体积较大的CTC被富集在过滤器中。经过May-Grünwald-Giemsa染色，显微镜下观察CTC或CTC集群的细胞形态。此法会导致一些体积较小的肿瘤细胞流失，只适用于体积较大的肿瘤细胞的检测。
基于肿瘤细胞表面抗原表达的上皮类标志物的ICCS一般作为检测CTC的标准方法。根据抗原抗体反应，通过染色进行观察。目前，在间质组织中检测上皮肿瘤细胞应用最为广泛的蛋白标志物是CK。也有研究者通过纳米金偶联链亲和素，或者免疫磁性纳米颗粒结合磁珠表面黏附的CK7/8单克隆抗体对细胞进行免疫化学染色[15]。需注意的是并非所有的肿瘤细胞都特异性表达EpCAM。
核酸分析法是一种非直接鉴定的方法，主要有PCR或RT-PCR进行核酸分析。它利用肿瘤特定的引物特异性转录检测样品中mRNA或DNA分子。但RNA有时候要从部分单核细胞中提取；另外，CTC标记基因的表达水平可能会有所不同，CTC的数量只能被估计，而且非肿瘤上皮细胞和非上皮细胞基因的异常转录亦可导致假阳性结果[16]。
微流控芯片技术是近几年研究较热的CTC检测技术，其检测原理主要为以下几种：（1）根据电流脉冲，通过微磁激活电脑芯片的两级微流控芯片，进行CTC异质性研究，扩展患者个体化治疗[17]；（2）利用固体微孔阵列，建立多孔道装置对细胞迁移进行测量，提高CTC的检测效率[18]；（3）通过微过滤通道的三维几何结构对CTC进行分离研究[19]；（4）根据尺寸和高通量的微流控芯片，经过滤通道从血液中分离CTC，其分离效率高，回收率好。
微流控芯片将富集和分析集于一体，在一定程度上减少了部分分离前血液处理的步骤，为后续的观察和计数也提供了便利。与传统的检测方法相比，不依赖表面标志物，可提高CTC的检出率和灵敏性，且操作简便，标本用量少，可批量测试及推广应用。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。有研究表明，CTC可作为乳腺癌早期转移的标志物[20]。每7.5 ml外周血中存在5个CTC可以作为转移性乳腺癌患者预后风险评估的标准cutoff值，当CTC的数量为0个时，为低风险；当CTC的数量在1~4个时，为中等风险；当CTC的数量≥5个时，为高风险；CTC的数量直接关系到患者的生存率，能够及时监测患者病情的发展，并且结合CK有助于肿瘤的分期。文献[20,21]报道CTC在转移性乳腺癌中的预后评估价值。炎性乳腺癌（IBC）是乳腺癌中最激进的一种形式，CTC的计数有助于IBC患者的诊断和治疗[22]。
近年来，肺癌逐渐成为全球范围内引起男女性死亡的主要原因，肺癌的5年生存率为10%~26%，晚期及转移性肺癌患者5年生存率仅为2%[23]。从病理学角度可将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌）[24]。不同于其他的肿瘤如乳腺癌和肝癌有特定的肿瘤标志物进行辅助检测，肺癌并没有相关特异性标志物进行辅助诊断[25]，越来越多的证据表明使用CTC为肺癌复发的早期检测液体活检，可预测疾病和监测治疗效果[26]。
小细胞肺癌的发病率较低，但病情进展迅速，易于转移，且死亡率较高[27]。小细胞肺癌有大量CTC的存在，这有助于更好地将CTC应用于临床。CTC不仅能够反映患者的生存期，还能预测患者的化疗反应。初期，CTC的数量<2个/ml的患者的生存较长，反之生存期较短。有大量的研究表明，在非小细胞肺癌中，CTC能够在治疗和预后监测中起到重要的作用[23]。目前表皮生长因子受体（EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（ALK）可以用于非小细胞肺癌，尤其是腺癌患者靶向治疗，但由于肿瘤异质性等使其临床应用受到限制，CTC有可能成为新的生物标志物来弥补这一缺陷[28]。
单个肺癌细胞在肿瘤生物学和转移过程中具有显著的潜力。CTC也可与其他肿瘤细胞、成纤维细胞、白细胞、内皮细胞和血小板形成聚集体，称为循环肿瘤微栓子。Tognela等[26]发现，与单细胞相比，循环肿瘤微栓子更具有远处转移的倾向，手术切除的非小细胞肺癌早期复发也与循环肿瘤微栓子相关联。因此，CTC的价值体现在肺癌的各个阶段，在疾病的早期，CTC可以用来预测复发风险，辅助治疗和评估预后，或监控、检测复发性疾病；治疗期间，CTC作为一种替代标志物来评估对治疗和指导有效的方法。
CTC作为液体活组织检查的一个组成部分具有很大的潜力。CTC的检测方法也从传统的免疫磁珠、CellSearch到新颖的芯片等逐渐多样化，虽然这些方法也存在着不足，如EpCAM的不完全表达、CTC的缺失、统一的判断标准缺乏等。但相信随着研究的不断深入，CTC一定具有非常广阔的应用前景。
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