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miR-497抑制结肠癌细胞HCT116炎症相关基因表达的基因芯片研究
肿瘤研究与临床, 2017,29(1) : 1-6. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2017.01.001
摘要
目的

采用基因芯片分析miR-497高表达对结肠癌细胞HCT116基因表达谱的影响。

方法

利用慢病毒感染人结肠癌细胞株HCT116，建立miR-497稳定高表达的结肠癌细胞模型HCT116-497细胞及阴性对照HCT116-CON细胞，用全基因组表达谱芯片筛选差异表达基因，利用MAS 3.0生物信息注释系统进行基因本体（gene ontology，GO）和信号通路富集分析（pathway analysis），筛选炎症相关基因。应用实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）对候选基因进行验证。

结果

筛选出绝对倍数变化（absolute fold change）3.0倍以上的下调基因582个，发现其主要富集于炎症相关细胞因子网络等信号通路。选取下调基因中参与细胞因子网络和MAPK信号通路的15个炎症相关基因进行PCR验证后显示，与HCT116-CON细胞相比，HCT116-497细胞中10个基因（CACNB1、FOS、IL-29、RPS6KA2、TNFSF15、IL-11、INHBC、CSF1R、JAK3和IL-2Rβ）表达水平降低，差异均有统计学意义（均P<0.05），与芯片结果一致。

结论

miR-497抑制结肠癌细胞HCT116中炎症相关基因mRNA的表达。

引用本文: 王娟娟, 杨瑞红, 王福花, 等.  miR-497抑制结肠癌细胞HCT116炎症相关基因表达的基因芯片研究 [J] . 肿瘤研究与临床, 2017, 29(1) : 1-6. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2017.01.001.
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结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是人类主要恶性肿瘤之一，大多数CRC的发生与环境和非遗传因素有关，其中慢性炎症是CRC发生发展的重要危险因素之一。越来越多的证据表明，许多微RNA（miRNA）可以调控炎症相关因子的表达，促进或抑制炎症相关肿瘤的发生[1]。miR-497位于17号染色体短臂13.1（17p13.1），属于miR-15/16/195/424/497家族成员。miR-497参与调节细胞周期、缺氧应激、血管通透性、DNA损伤修复、细胞凋亡等一系列过程[2,3,4,5]。近年来研究发现，miR-497表达下调与CRC、乳腺癌、黑色素瘤、肾上腺皮质癌、头颈部鳞状细胞癌等多种肿瘤发生关系密切，因此被视作一个肿瘤抑制基因[2,3]。我们的前期工作也证实在结肠癌组织和结肠癌细胞系中miR-497低表达，并且发现miR-497能够抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭能力，促进凋亡发生[6]。研究表明，结肠癌引发的炎症反应可以促进肿瘤的发展和转移[7]。为了确定miR-497高表达对结肠癌细胞基因表达谱的影响，探索miR-497是否参与结肠癌相关炎症反应，我们建立了miR-497稳定高表达的结肠癌细胞株，利用人基因组表达谱芯片筛选差异表达基因，结合生物信息学方法对差异基因进行基因本体（gene ontology，GO）和信号通路富集分析（pathway analysis），筛选可能受miR-497调控的炎症相关基因，为下一步研究miR-497调控结肠癌炎症反应的机制及其效应奠定基础。

1　材料与方法
1.1　材料与试剂

人结肠癌细胞株HCT116购自美国菌种保藏中心（ATCC）细胞库，DMEM培养液购自美国Corning公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，过表达LV-hsa-miR-497及阴性对照慢病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，筛选剂嘌呤霉素（puromycin）购自美国Sigma公司。RNA提取试剂TRIzol购自日本TaKaRa公司，NucleoSpin RNA clean-up试剂盒购自德国Macherey-Nagel公司，全基因组表达谱芯片采用美国Agilent公司Human（V2）Gene Expression Microarray 8×60K芯片，实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit和SYBR Select Master Mix购自美国ABI公司，引物由美国国立生物技术信息中心（NCBI）的Primer-BLAST在线设计，由上海生工生物工程有限公司合成，荧光定量PCR仪ViiA 7 Real-Time PCR System购自美国Applied Biosystems公司。

1.2　miR-497高表达结肠癌细胞株及对照细胞株的建立

将处于对数生长期的HCT116细胞分别接种于6孔板的3个孔中，4×105/孔，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液2 ml/孔，在37 ℃、5% CO2、湿度适宜的培养箱中培养，待细胞贴壁生长融合度达60%~70%后，按感染复数（multiplicity of infection，MOI）为10分别加入LV-hsa-miR-497慢病毒及阴性对照病毒液，12 h后更换为新鲜培养液，48~72 h后于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，确定感染效率。用嘌呤霉素（终浓度为5 μg/ml）筛选细胞克隆，稳定转染miR-497的HCT116细胞（HCT116-497细胞）作为实验组，阴性对照病毒感染的HCT116细胞（HCT116-CON细胞）作为阴性对照组，未经感染的HCT116细胞为空白对照组。

1.3　全基因组表达谱芯片筛选miR-497过表达后的差异表达基因

TRIzol法提取miR-497高表达的HCT116-497细胞、阴性对照HCT116-CON细胞及空白对照HCT116细胞总RNA，对其纯化。将总RNA反转录合成cRNA并纯化，以cRNA为模板，Random Primer为引物，反转录得到DNA并定量。以反转录的DNA产物为模板，Random Primer为引物，用Klenow Fragment酶合成DNA互补链，并掺入带有荧光基团的dNTP（Cy3-dCTP）。纯化并定量标记产物。标记的DNA再与表达谱芯片上探针杂交，清洗后用Agilent芯片扫描仪（G2565CA）对芯片扫描，得到杂交图片，使用Agilent Feature Extraction（v10.7）软件提取数据及预处理分析，然后采用GeneSpring GX软件计算基因表达差异。差异基因筛选标准为绝对倍数变化（absolute fold change）在2.0倍以上。采用Cluster 3.0软件对基因进行聚类分析。

1.4　qRT-PCR检测miR-497表达及验证差异表达基因

TRIzol法提取细胞总RNA，按照美国ABI公司反转录试剂盒说明反转录2 μg RNA，合成cDNA单链，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。miR-497、U6反转录引物序列分别为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATAC-3'和5'-AACGCTTC ACGAATTTGCGT-3'，其他PCR引物序列见表1。扩增体系为10 μl：SYBR Select Master Mix（2×）5 μl，10 μmol/L上、下游混合引物1 μl，cDNA模板2 μl，无核酶水2 μl。反应条件为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。以GAPDH作为差异表达基因的内参，以U6为miR-497内参，qRT-PCR数据采用2-ΔΔCt相对定量法计算。

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表1

实时定量聚合酶链反应扩增基因的引物序列

表1

实时定量聚合酶链反应扩增基因的引物序列

基因上游（5'→3'）下游（5'→3'）
miR-497GTGCAGGGTCCGAGGTTAGCCTGCAGCACACTGTGGT
U6AACGCTTCACGAATTTGCGTCTCGCTTCGGCAGCACA
GAPDHGGATTTGGTCGTATTGGGGGAAGATGGTGATGGGATT
CACNB1TCAAACGGTCAGATGGGAGCCTTAAGGCTTCCCGGTCCTC
FOSGGGGCAAGGTGGAACAGTTAAGTTGGTCTGTCTCCGCTTG
IL-29TTGCAGCTCTCCTGTCTTCCCAGGACCTTCAGCGTCAGG
RPS6KA2CATGAAGAAGTTCGCCGTGCGCCTTCTCAAAGCCCTCCTT
TNFSF15GCAGGACTCACCACATACCTTGTGAAGGTGCAAACTCCTGT
IL-11AGCGGACAGGGAAGGGTTACTGTATCTGGCCACAGGCTC
JAK3CCACTCCCTCTTTGCTCTGGCCTGTACAGCAGGACTTGGG
IL-2RβCCTGTACAGCAGGACTTGGGAAATGGTCAGCAGCCCTCTC
INHBCGAGGACAACAGGGAACAGGAAACATGAGACTGGCCTGCTG
CSF1RGCAGACAGAGTGTCCAAAAGCTCCTTGGGCTGATCCTCTTCT
1.5　生物信息学分析及统计学方法

采用MAS 3.0（Molecule Annotation System 3.0）生物信息注释系统对差异表达基因进行GO分析，采用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）公共数据库进行信号通路分析。

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　感染病毒的细胞miR-497表达水平

qRT-PCR检测显示，与HCT116-CON细胞相比，HCT116-497细胞的miR-497成熟体表达量明显增高，差异有统计学意义（1.00±0.18比77.49±5.73，样本数为3，P=0.003）。表明筛选出的HCT116-497细胞能稳定高表达成熟的miR-497序列。

2.2　miR-497稳定高表达细胞株与阴性对照细胞株差异表达基因谱

按绝对倍数变化在2.0倍以上的标准筛选差异表达基因并进行聚类分析结果（图1）。在绝对倍数变化3.0倍以上的差异表达基因中，有功能注释的基因共1 053个，其中471个基因表达上调，582个基因表达下调。

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图1
全基因组表达谱芯片筛选miR-497过表达后人结肠癌HCT116细胞差异表达基因
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HCT116-497细胞为miR-497过表达细胞，HCT116-CON细胞为阴性对照细胞；1A：比较分析散点图，红色和绿色标记的数据点分别表示HCT116-497细胞与HCT116-CON细胞倍数变化（fold change）≥2.0和≤-2.0的基因，黑色标记表示倍数变化-1.9~1.9的基因，为表达基本无差异的基因；1B：聚类分析图，红色为表达上调，绿色为表达下调

图1
全基因组表达谱芯片筛选miR-497过表达后人结肠癌HCT116细胞差异表达基因
2.3　miR-497过表达后下调差异基因的GO与KEGG通路分析

将绝对倍数变化3.0倍以上的差异表达基因上传至MAS 3.0系统（http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/）进行GO分析，按生物学过程（biological process）、细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）进行功能注释。在生物学过程分类中，HCT116细胞过表达miR-497后下调基因富集于免疫和炎症反应的基因共45个，占前十位GO分类的17%（图2）。对绝对倍数变化3.0倍以上差异基因行KEGG通路分析显示，HCT116细胞过表达miR-497后下调基因主要与细胞因子受体作用网络、细胞黏附分子、JAK-STAT、MAPK、钙等信号通路有关（P<0.05，Q<0.05）（表2），其中细胞因子受体作用网络、JAK-STAT、MAPK等通路与炎症反应相关。

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图2
人结肠癌细胞HCT116过表达miR-497后前十位下调基因的基因本体（GO）功能注释（生物学过程分类）
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图2
人结肠癌细胞HCT116过表达miR-497后前十位下调基因的基因本体（GO）功能注释（生物学过程分类）
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表2

人结肠癌HCT116细胞过表达miR-497后下调基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集结果

表2

人结肠癌HCT116细胞过表达miR-497后下调基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集结果

通路基因数（个）P值Q值基因
细胞因子-细胞因子受体相互作用176.54×10-112.4×10-9TNFSF15、 IL-20Rα、 CD27、 IL-29、 INHBC、 CXCL11、 IL-2Rβ、 CSF1R、 TNFRSF6B、 EGF、LTB、CCL26、NGFR、IL-11、CSF2、INHBB、CCL3
细胞黏附分子81.45×10-55.4×10-5MPZ、PTPRC、HLA-DQA1、HLA-DOB、CLDN6、NCAM1、HLA-DQB1、HLA-DRB3
JAK-STAT信号通路84.12×10-51.0×10-4IL-20Rα、IL-29、IL-2Rβ、SPRY4、JAK3、IL-11、CSF2、CBLB
钙信号通路81.37×10-43.3×10-4CACNA1C、PTGER3、BDKRB2、BDKRB1、CACNA1B、ADRB1、ADRB2、SPHK1
MAPK信号转导通路94.41×10-48.5×10-4FGF5、CACNA1C、NTRK2、NTRK1、CACNA1B、EGF、RPS6KA2、CACNB1、PLA2G2F
肌动蛋白细胞骨架的调节72.00×10-33.0×10-3FGF5、BDKRB2、BDKRB1、ITGB6、EGF、ITGAX、VAV2
mTOR 信号通路38.60×10-39.3×10-3PGF、RPS6KA2、ULK2
Hedgehog信号通路31.10×10-21.1×10-2WNT7A、WNT4、BMP6
TGF-β信号通路33.36×10-22.8×10-2INHBC、BMP6、INHBB

注：TGF-β为转化生长因子β；P值为相关基因富集于特定信号通路的超几何分布概率，Q值为FDR校正后的P值，一般认为P<0.05、Q<0.05为差异有统计学意义

2.4　miR-497过表达后部分下调炎症相关基因的qRT-PCR验证

选取下调基因中参与细胞因子网络和MAPK信号通路的15个炎症相关基因进行PCR验证。结果显示，与HCT116-CON细胞相比，HCT116-497细胞中10个基因（CACNB1、FOS、IL-29、RPS6KA2、TNFSF15、IL-11、INHBC、CSF1R、JAK3和IL-2Rβ）表达水平降低（均P<0.05）（表3），与芯片结果一致。

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表3

qRT-PCR检测miR-497过表达及阴性对照人结肠癌HCT116细胞中炎症相关基因的相对表达量（±s）

表3

qRT-PCR检测miR-497过表达及阴性对照人结肠癌HCT116细胞中炎症相关基因的相对表达量（±s）

组别样本数CACNB1FOSIL-29RPS6KA2TNFSF15IL-11INHBCCSF1RJAK3IL-2Rβ
HCT116-CON30.95±0.040.90±0.010.93±0.110.85±0.131.13±0.151.16±0.140.94±0.211.10±0.101.15±0.180.96±0.04
HCT116-49730.46±0.080.31±0.070.52±0.020.10±0.050.17±0.040.53±0.130.19±0.180.10±0.060.38±0.020.44±0.07
P值 0.0010.0010.0030.0010.0000.0050.0090.0000.0020.000

注：qRT-PCR为实时定量反转录聚合酶链反应；HCT116-497细胞为miR-497过表达细胞；HCT116-CON细胞为阴性对照细胞

3　讨论

miRNA是一类小的内源性非编码RNA，长度在22个核苷酸左右，在转录后水平调控基因表达。miRNA前体经加工成熟后，参与形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），通过碱基互补配对的方式识别靶基因mRNA 3'端非翻译区（3' UTR），根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译，从而抑制基因的表达[8]。考虑到miRNA的作用方式是与靶基因互补结合而抑制其表达的，所以本研究着重关注miR-497过表达后下调的基因。

慢性肠道炎症是CRC发生的重要危险因素，炎症性肠病（inflammatory bowel diseases，IBD）患者发展为炎症相关性CRC的风险很高。另外，研究发现，虽然只有2%的CRC在发病前存在慢性炎症，但是在大多数CRC中炎症相关基因表达也上调[7]。由此可见，炎症反应不仅可以引起CRC的发生，而且由CRC引发的炎症反应能够促进肿瘤的发展和转移。阿司匹林等抗感染药可以减轻CRC引发的炎症，抑制肿瘤生长，也表明肿瘤引发的炎症在肿瘤进展中有促进作用[7]。细胞因子网络介导的炎症和抗肿瘤免疫在肿瘤的发生发展尤其是CRC中起着关键作用[9]。miR-497过表达后，富集于炎症因子网络的下调基因大多属于肿瘤坏死因子（TNF）家族、转化生长因子β（TGF-β）、趋化因子家族，其中IL-29、TNFSF15、IL-11、INHBC、CSF1R、JAK3和IL-2Rβ的mRNA表达下调在miR-497稳定高表达的结肠癌细胞株中得到了验证。TNF与肠道肿瘤发生关系密切，可促进结肠上皮细胞的上皮-间质转化（EMT）[10]。下调的TNF家族基因包括TNFSF15、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF6B、LTB（TNFSF3）、NGFR（TNFRSF16）。TNFSF15是溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的易感基因，其蛋白产物TNF样配体1A（TNF-like molecule 1A，TL1A）的受体包括死亡受体3（death receptor 3，DR3）和诱骗受体3（decoy receptor 3，DcR3），DR3和DcR3竞争性结合TL1A，从而影响肠黏膜T细胞的活化、增殖、凋亡以及炎症反应，在肠道炎症反应、免疫应答中发挥重要作用。此外，TNFSF15基因的多态性与IBD疾病发展的严重程度有关[11]。

许多研究报道IL-11可能参与胃癌、CRC、前列腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤的发生，IL-11Rα表达水平与胃肠道肿瘤的转移程度相关。IL-11与其受体IL-11Rα结合可激活JAK-STAT3、RAS-RAF-ERK和PI3K-AKT-mTORC1信号通路，它们在维持肠黏膜稳态、调节促炎细胞因子表达及细胞增殖与凋亡中均具有重要作用[12]。IL-11是IL-6家族成员，在CRC中高表达，与磷酸化STAT3的相关性比IL-6还要高[13]。此外，高表达TGF-β与CRC尤其是晚期患者预后差负相关[14]，TGF-β还可促进肿瘤相关成纤维细胞（CAF）分泌IL-11，导致STAT3信号介导的CRC多器官转移[15]。研究表明趋化因子及其受体所组成的网络在CRC的增殖、侵袭和转移中发挥重要作用[16]。另外，集落刺激因子（CSF）及其受体也可以介导肿瘤细胞的趋化作用，从而影响肿瘤的转移。

JAK-STAT通路在炎症和肿瘤中均具有重要作用。有研究表明JAK3在肺癌细胞系和结肠癌细胞系中均有表达[17]。细胞因子介导的JAK-STAT信号通路在维持肠道稳态和肠黏膜上皮损伤与修复中发挥重要作用，JAK3和STAT3活化是炎症和肿瘤之间的重要桥梁[18]。IL-2Rβ和IL-2Rα、IL-2Rγ异源三聚体组成IL-2R，主要在淋巴细胞里表达。研究发现在CAF、内皮细胞、肠上皮细胞和肾上皮细胞中也有IL-2R表达[19]。IL-2Rβ可激活JAK-STAT、RAS-RAF-ERK MAPK和PI3K信号通路，促进细胞增殖[20]。IL-2可以通过调节肠上皮细胞的增殖和凋亡维持肠上皮细胞的稳态，IL-2与其受体结合后可活化JAK3，引起肠上皮细胞增殖[21]。本研究PCR结果证实，在miR-497高表达的结肠癌细胞株HCT116中IL-2Rβ、JAK3 mRNA表达水平下调，其蛋白表达水平有待后续实验验证。

综上所述，我们的研究结果初步表明，在结肠癌HCT116细胞中miR-497可以下调细胞因子等炎症相关基因的表达，其具体机制和miR-497是否通过下调炎症因子进而调控结肠癌细胞的增殖、分化和转移有关还有待进一步研究。

利益冲突
利益冲突

无

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结肠肿瘤
炎症相关基因
基因本体
信号通路富集分析
HCT116细胞
结肠癌细胞HCT116
差异表达基因
基因芯片
过表达