探讨热疗对人肺癌细胞株H1299生物学功能的影响及其可能的分子机制。
体外培养H1299细胞，实验分为两组，热疗组细胞采用水浴箱恒温43 ℃加热1 h，对照组细胞置于37 ℃培养箱培养。采用CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡率，Transwell法检测细胞迁移及侵袭，Western blot法检测LLGL1蛋白表达。
热疗对细胞周期分布无明显影响，但热疗组细胞凋亡率为（24.81±2.80）%，较对照组的（11.73±1.55）%升高，差异有统计学意义（t=7.709，P=0.002 1）。热疗组迁移细胞数为（25.67±4.81）个，对照组为（85.00±10.31）个，两组差异有统计学意义（t=5.182，P=0.006 6）；热疗组侵袭细胞数为（22.00±2.08）个，对照组为（108.30±10.14）个，两组差异有统计学意义（t=8.342，P=0.001 1）。热疗组细胞LLGL1蛋白表达水平显著上调，为对照组的4.2倍，差异有统计学意义（t=3.028，P=0.038 9）。
热疗可诱导人肺癌H1299细胞凋亡，并可抑制其迁移和侵袭，其作用可能是通过促进LLGL1的表达实现的。
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2012年全球大约有180万新发肺癌患者，占所有新发肿瘤的13%，患者总体5年生存率为17.1%，Ⅳ期患者仅占3.6%[1,2]。2014年中国肿瘤年鉴显示肺癌在我国的发病率和死亡率均居首位[3]。大部分肺癌患者在就诊时已为晚期，丧失了根治性手术或放疗的最佳时机，许多患者不能耐受细胞毒药物化疗的不良反应，而靶向治疗适用人群有限。近年来热疗技术不断发展，其在肿瘤治疗方面的价值及原理日益清晰，也在临床应用方面显示出其独特的价值。有报道显示热疗可以抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长[4]，并有热疗联合贝伐珠单抗治愈肺癌骨转移的病例报告[5]。我们的前期研究显示热疗联合胸腔灌注白细胞介素2（IL-2）对恶性胸腔积液有明显控制作用[6]。但目前对于热疗抑制肺癌细胞生长及侵袭转移的机制尚不明确。LLGL1为果蝇同源性抑癌基因，其缺失将导致细胞极性破坏、细胞无限制扩增和肿瘤发生[7]。本研究观察热疗对人肺癌细胞株H1299生物学功能的影响及其与LLGL1蛋白表达的关系，探讨其可能的抑癌机制，为热疗的临床应用提供实验依据。
人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株H1299由中国医学科学院肿瘤医院胸外科实验室惠赠，RPMI 1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自美国HyClone公司，兔抗人LLGL1单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，山羊抗兔二抗购自美国Abgent公司。细胞增殖实验试剂选用日本同仁化学研究所Dojindo公司的CCK-8试剂盒，细胞周期检测使用南京凯基公司细胞周期检测试剂盒，细胞凋亡检测使用美国BD Pharmingen公司的FITC AnnexinⅤ Apoptosis Detection KitⅠ试剂盒。Transwell小室购自美国Corning及BD Biosciences公司。
使用RPMI 1640培养液培养细胞，添加10%胎牛血清和1%的青霉素和链霉素。置于37 ℃、5% CO2、98%相对湿度条件下进行培养。当细胞融合率为70%~80%时，用0.25%胰蛋白酶消化并传代，收集处于对数生长期的细胞用于实验。
对照组：不做任何处理，置于培养箱内培养，实验前1~2 d传代。热疗组：随机取3瓶细胞，将瓶口拧紧并用封口膜封口，置于43 ℃水浴箱内加热1.5 h后换液，放回37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养24 h[8]。
将两组细胞分别以1.5×103/孔接种于96孔板中过夜，每组设6个复孔，分别于热疗后24、48、72 h进行CCK-8增殖检测，将CCK-8原液按1∶9稀释到RPMI 1640完全培养液中，充分混匀。将待测细胞的培养液吸去，加入100 μl稀释好的CCK-8溶液，并在6个空孔中加入稀释好的CCK-8溶液作为空白对照，培养2.5 h后进行检测，用酶标仪检测吸光度（A）值并绘制细胞增殖曲线。
热疗组和对照组各取3个平行样本，收集细胞，PBS洗涤，进行细胞计数，使细胞悬液的最终密度达到1×106/ml。70%乙醇4 ℃条件下固定至少12 h，预冷PBS洗涤后，RNA酶作用30 min，避光加入碘化丙啶（PI）50 μg/ml，30 min后流式细胞术检测，分析各组细胞周期分布。
应用Annexin V-PI双染法流式细胞仪检测肺癌细胞凋亡率，取两组H1299细胞，用胰酶消化，离心半径15 cm，1 000 r/min离心10 min，弃上清。加入1 ml预冷的PBS洗涤，轻轻吹打使细胞悬浮，重复上述步骤。将细胞重悬于250 μl上样缓冲液中，加入5 μl FITC-AnnexinⅤ，避光静置15 min，再加入5 μl PI，轻轻混匀，室温避光反应5 min，向每个EP管内加入400 μl的AnnexinⅤ结合缓冲液，在10 min之内上机检测。
实验前将两组细胞去血清饥饿培养12 h，将Transwell小室或已包被Matrigel的侵袭小室置于37 ℃培养箱中水化60 min，在上室加入含有3×104个或8×104个细胞的无血清RPMI 1640培养液100 μl，下室加入含20% FBS的培养液600 μl，在37 ℃、5% CO2条件下培养12 h。然后取出小室，小心吸去多余培养液，用棉签轻轻擦掉上室细胞，甲醇室温固定2 min，进行吉姆萨染色，7 min后洗去染液。最后将小室底膜切下封固，在光学显微镜（×100）下拍照并计数细胞。
将两组细胞消化后用预冷的PBS漂洗2次，移入2 ml EP管中，向其中加入新鲜配制的细胞裂解液RIPA 500 μl，冰上裂解15 min，12 000×g、4 ℃离心15 min，取上清液，再加入5倍的蛋白上样缓冲液，吹打混匀后置于水浴中，99 ℃煮30 min。采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。各组细胞取20 μg蛋白行10% SDS-PAGE电泳，并将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脱脂奶粉的TBS封闭液室温封闭1 h后，加入一抗（1∶1 000稀释），4 ℃反应过夜，TBST洗膜3次（5 min/次），加入HRP标记的二抗（1∶10 000稀释），室温培养1 h，TBST洗膜3次（5 min/次），最后电化学发光显影。应用图像分析软件Image J测定条带的灰度值，以目的蛋白和内参照蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。
采用Graphpad prism 6统计软件对实验结果进行统计学分析。实验至少重复3次。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用Student t检验，两组间A450值的比较采用两因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
CCK-8结果显示，热疗组细胞的增殖速度低于对照组，热疗24 h后，H1299细胞增殖能力明显减弱。两组24、48、72 h的A450值差异均有统计学意义（t值分别为3.311、4.089、7.108，均P<0.01）（图1）。
与热疗组同时间点比较，aP<0.01，bP<0.001
热疗对H1299细胞周期无明显影响，但可明显促进肺癌细胞凋亡，与对照组细胞凋亡率（11.73±1.55）%相比，热疗组肺癌为（24.81±2.80）%，两组差异有统计学意义（t=7.709，P=0.002 1）。
Transwell实验显示，热疗组肺癌细胞迁移能力明显受到抑制，热疗组迁移细胞数为（25.67±4.81）个，对照组为（85.00±10.31）个，两组差异有统计学意义（t=5.182，P=0.006 6）。此外，细胞的侵袭能力也明显受到抑制，热疗组侵袭细胞数为（22.00±2.08）个，对照组为（108.30±10.14）个，两组差异有统计学意义（t=8.342，P=0.001 1）（图2）。
Western blot结果显示，热疗组LLGL1蛋白表达水平较对照组增高（t=3.028，P=0.038 9），热疗组LLGL1蛋白表达水平为对照组的4.2倍（图3）。
肺癌的发病率和死亡率在我国均居首位，大部分病例发现时均属晚期，手术效果差，放化疗不敏感且毒副作用较大，因此探寻新的有效治疗方法以提高肺癌患者生存率迫在眉睫。热疗作为一种"绿色"肿瘤辅助疗法已被用于临床治疗，多项随机临床试验证实热疗可促进放化疗疗效，控制肿瘤局部进展，有益于患者生存[9]。但大部分研究局限于热疗可以促进肿瘤血液灌注、改善药物递送、同时可增加肿瘤氧合进而改善放疗敏感性方面。我们前期试验证实热化疗可增强胃癌患者B淋巴细胞、T淋巴细胞及NK细胞表达，增强机体免疫系统功能，包括体液免疫、细胞免疫与非特异性免疫[10]。Mikucki等[11]研究发现热疗可促使炎症因子IL-6发挥抗肿瘤活性，亦有关于热疗可诱导食管癌细胞凋亡的报告[12]。Cai等[13]研究显示热疗联合模拟CO2气腹可抑制bcl-2、基质金属蛋白酶2、ICAM-1和CD44的表达，并促进Bax和E-cadherin表达，进而抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和转移。提示热疗可通过多种途径参与肿瘤转归与治疗。
LLGL1最早在果蝇中被发现，它的缺失将抑制果蝇幼虫神经母细胞的分化并促进其侵袭。人类同源性LLGL1基因编码细胞骨架蛋白，参与维持细胞极性及上皮细胞完整性，目前已证实其在多种肿瘤中表达，发挥抑癌基因作用，过表达LLGL1的结直肠癌、食管癌细胞系可增加细胞黏附，减弱细胞侵袭、转移能力，并可诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能是LLGL1参与肿瘤上皮-细胞间质转化（EMT）及激活线粒体途径的凋亡[14,15,16]，但鲜见关于热疗对其表达影响的报道。
综上所述，热疗可明显抑制肺癌细胞的迁移、侵袭，促进肺癌细胞凋亡，并且其作用的发挥可能是通过促进LLGL1的表达来实现的，这为肺癌热疗的临床应用提供了重要的分子理论依据。
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