研究缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）在肺腺癌中的表达及其与肿瘤转移的相关性。
应用免疫组织化学方法检测125例肺腺癌患者（未转移肺腺癌41例、淋巴结转移38例、脑转移46例）的GLUT1及HIF-1α的蛋白表达情况。采用χ2检验和Pearson相关分析GLUT1及HIF-1α的表达及其相关性。
组织学上肺腺癌肿瘤组织异质性较大，多数肿瘤中均包含两种及以上不同的腺癌结构。未转移肺腺癌中以腺泡为主型腺癌多见（73.2 %，30/41）；淋巴结转移肺腺癌中以腺泡为主型腺癌（53.6 %，15/38）和实性为主型腺癌（26.3 %，10/38）多见；脑转移肺腺癌中以乳头为主型腺癌（47.8 %，22/46）和实性为主型腺癌（34.8 %，16/46）多见。GLUT1及HIF-1α表达在淋巴结转移和脑转移肺腺癌组比未转移肺腺癌组明显增高（均P<0.05）；GLUT1与HIF-1α的表达呈正相关（r=0.407，P=0.000）。
肺腺癌脑转移患者组织学上多为乳头型腺癌，提示乳头状腺癌更容易出现脑转移。HIF-1α及GLUT1的表达在肺腺癌淋巴结转移和脑转移中发挥重要作用。
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缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是介导细胞对缺氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控基因，能激活许多缺氧反应性基因的表达，使组织产生一系列适应反应而得以在缺氧状态下生存[1]。HIF-1α可促进肿瘤细胞葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）基因的表达，以满足肿瘤生长的能量需求。近年研究表明，在胃癌、鼻咽癌及乳腺癌中均发现HIF-1α和GLUT1表达水平高度相关，且在肿瘤的淋巴结转移中起重要作用[2,3,4]。肺癌目前发病率及死亡率均居首位，对于晚期肺癌患者而言，远处转移是导致死亡的主要原因之一，其中脑转移患者的死亡率为23 %~65 %，中位生存期为3~12个月[5,6]。但是在肺腺癌中，HIF-1α和GLUT1的表达是否与肿瘤的转移，尤其是脑转移的相关性目前尚鲜见明确的报道。本研究分析41例未转移肺腺癌、38例淋巴结转移肺腺癌及46例脑转移肺腺癌组织中HIF-1α及GLUT1蛋白表达及其相关性，探讨HIF-1α及GLUT1表达与肺腺癌转移程度的相关性。
选择首都医科大学宣武医院2014年9月至2017年2月肺腺癌患者手术切除标本125例。其中男性61例，女性64例；年龄27~77岁，中位年龄60.3岁。根据国际肺癌协会（IASLC）2016年版肺部恶性肿瘤TNM分期标准[7]：Ⅰ期40例，Ⅱ期18例，Ⅲ期21例，Ⅳ期46例。组织学分类依据2015版肺癌世界卫生组织（WHO）分类标准[8]。
GLUT1兔抗人多克隆抗体（ZA-0471）、HIF-1α兔抗人单克隆抗体（ZA-0552），二步法免疫组织化学检测试剂盒（PV-9000）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、APES防脱片胶工作液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片机、Olympus光学显微镜、医用微波炉。
采用SP二步法进行免疫组织化学染色。步骤如下：石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3 % H2O2中常温培养10 min，PBS冲洗3次，每次5 min。将切片置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH值6.0）中煮沸（95 ℃，15~20 min），进行抗原修复，冷却至室温。一抗4 ℃培养过夜，PBS冲洗3次，每次5 min；二抗培养30 min，PBS冲洗，DAB染色，苏木精对比染色1 min，乙醇梯度脱水，二甲苯中性胶封固。PBS代替一抗作为阴性对照。
HIF-1α蛋白染色阳性细胞标准为胞质或胞核内可见棕黄色颗粒。GLUT1蛋白染色阳性细胞标准为胞膜或胞质内出现棕黄色颗粒。参考文献[3]方法进行半定量评定，根据阳性细胞的数量和染色强度进行计分。染色强度：不着色为0分，轻度着色为1分，中度着色为2分，重度着色为3分；阳性细胞数量：<10 %为1分，10 %~50 %为2分，>50 %为3分。上述两项积分之和为免疫组织化学总积分，总积分≤2分为阴性，3~6分为阳性。
采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验进行比较；相关性分析采用Pearson相关分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。
41例未转移肺腺癌病例中，男性19例，女性22例，中位年龄61岁（47~77岁）。Ⅰ期40例，Ⅱ期1例。组织学观察，肿瘤组织异质性较大，多数肿瘤中均包含2种及以上不同的腺癌结构，其中腺泡为主型30例（73.2%），实性为主型5例（12.2 %），贴壁为主型5例（12.2 %），肠型1例（2.4 %）（图1）。
1A：贴壁为主型，癌细胞呈贴壁生长，无间质、脉管或胸膜浸润，无乳头或微乳头结构，肺泡腔内无癌细胞聚集；1B：腺泡为主型，主要成分为具有中心管腔的圆形或卵圆形腺体；1C：实性为主型，主要由片状多角型细胞组成，缺乏可辨认的腺癌结构，肿瘤呈100 %实性生长；1D：乳头为主型，主要由具有纤维血管轴心的分支乳头（箭头所示）构成；1E：微乳头为主型，肿瘤细胞形成无纤维血管轴心的乳头状细胞簇；1F：微乳头播散，视野内可见多个微乳头
38例淋巴结转移肺腺癌病例中，男性20例，女性18例，中位年龄62岁（47~77岁）。Ⅱ期17例，Ⅲ期21例。组织学观察，腺泡为主型15例（53.6 %），实性为主型10例（26.3 %），乳头为主型7例（18.4 %），微乳头为主型5例（13.2 %），贴壁为主型并伴有微乳头型1例（2.6 %）。
46例脑转移肺腺癌病例中，男性22例，女性24例，中位年龄57岁（27~77岁）。30例转移部位于大脑幕以上，其中额叶14例，顶叶5例，枕叶5例，颞叶3例，多发转移病灶3例。16例病例转移部位于小脑。1例为囊性病变，破碎脑组织呈囊壁样结构，囊壁内腺癌浸润，部分为管状型，部分为筛状型，伴片状出血、坏死。组织学观察，乳头为主型22例（47.8 %），实性为主型16例（34.8 %），腺泡为主型8例（17.4 %）。
125例肺腺癌患者中，HIF-1α蛋白阳性表达率为29.6 %（37/125）（图2）。不同性别之间HIF-1α的表达差异无统计学意义（P>0.05）。HIF-1α蛋白表达与患者年龄相关（χ2=4.123，P=0.042），年龄较大的患者表达率更高。淋巴结转移阳性组、脑转移阳性组HIF-1α的阳性表达率均明显高于肿瘤未转移组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。HIF-1α阳性表达与患者的临床分期密切相关（P<0.05）。HIF-1α在实性为主型肺腺癌中的阳性表达率为38.7 %（12/31）（表1）。
2A：腺癌细胞HIF-1α蛋白表达阴性；2B：实性分布肺腺癌细胞散在表达HIF-1α；2C：HIF-1α在肺腺癌淋巴结转移中的阳性表达，腺癌细胞胞质和胞核可见棕黄色颗粒；2D：HIF-1α在肺腺癌脑转移中的阳性表达
缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与葡萄糖转运蛋白1 （GLUT1）的表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系[例（%）]
缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与葡萄糖转运蛋白1 （GLUT1）的表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系[例（%）]
| 临床病理特征 | 例数 | HIF-1α | GLUT1 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | χ2值 | P值 | 阳性 | χ2值 | P值 | |||
| 性别 | ||||||||
| 男 | 61 | 15（24.6） | 1.435 | 0.231 | 38（62.3） | 0.150 | 0.698 | |
| 女 | 64 | 22（34.4） | 42（65.6） | |||||
| 年龄（岁） | ||||||||
| ≥60 | 67 | 25（37.3） | 4.123 | 0.042 | 46（68.7） | 1.359 | 0.244 | |
| <60 | 58 | 12（20.7） | 34（58.6） | |||||
| 淋巴结转移 | ||||||||
| 否 | 41 | 6（14.6） | 7.407 | 0.006 | 18（43.9） | 8.598 | 0.003 | |
| 是 | 38 | 16（42.1） | 29（76.3） | |||||
| 脑转移 | ||||||||
| 否 | 41 | 6（14.6） | 4.658 | 0.031 | 18（43.9） | 9.432 | 0.002 | |
| 是 | 46 | 15（32.6） | 33（71.7） | |||||
| 肿瘤分期 | ||||||||
| Ⅰ | 40 | 4（10.0） | 17（42.5） | |||||
| Ⅱ | 18 | 9（50.0） | 19.208 | 0.000 | 14（77.8） | 9.800 | 0.002 | |
| Ⅲ | 21 | 8（39.1） | 14（66.7） | |||||
| Ⅳ | 46 | 16（34.8） | 35（76.1） | |||||
| 组织学类型 | ||||||||
| 腺泡为主型 | 53 | 12（22.7） | 31（58.5） | |||||
| 实性为主型 | 31 | 12（38.7） | 24（77.4） | |||||
| 乳头为主型 | 29 | 9（31.0） | - | - | 20（68.9） | - | - | |
| 微乳头为主型 | 5 | 2（60.0） | 3（60.0） | |||||
| 贴壁为主型 | 6 | 1（16.7） | 1（16.7） | |||||
| 肠型腺癌 | 1 | 1（100.0） | 1（100.0） | |||||
注："-"为因组间样本量相差太大，无法统计
125例肺腺癌中，GLUT1蛋白阳性表达率为64.0 %（80/125）（图3）。不同性别、年龄之间GLUT1的表达差异无统计学意义（均P>0.05）。淋巴结转移组、脑转移组GLUT1的阳性表达率均明显高于肿瘤未转移组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。GLUT1阳性表达与肺癌的临床分期密切相关（P<0.05）。GLUT1在实性为主型肺腺癌中的阳性表达率为77.4 %（24/31）（表1）。
3A：正常支气管肺泡上皮细胞GLUT1蛋白表达阴性；3B：肺腺癌细胞GLUT1阳性表达；3C：GLUT1在肺腺癌淋巴结转移中的阳性表达，腺癌细胞胞膜和胞质可见棕黄色染色；3D：GLUT1在肺腺癌脑转移中的阳性表达
125例肺腺癌中，GLUT1与HIF-1α的表达相关（χ2=21.274，P<0.05）。进一步分析可知，在未转移肺癌组、淋巴结转移组及脑转移肺腺癌组中，GLUT1的表达与HIF-1α的表达均相关（均P<0.05）（表2）。Pearson相关分析显示，GLUT1与HIF-1α的表达呈正相关（r=0.407，P=0.000）。
缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与葡萄糖转运蛋白1 （GLUT1）蛋白表达的关系（例）
缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与葡萄糖转运蛋白1 （GLUT1）蛋白表达的关系（例）
| 项目 | HIF-1α | χ2值 | P值 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴性 | ||||
| GLUT1 | |||||
| 阳性 | 34 | 46 | 17.746 | 0.000 | |
| 阴性 | 3 | 42 | |||
| 未转移肺腺癌 | |||||
| GLUT1阳性 | 5 | 13 | 4.437 | 0.035 | |
| GLUT1阴性 | 1 | 22 | |||
| 淋巴结转移 | |||||
| GLUT1阳性 | 15 | 14 | 4.647 | 0.031 | |
| GLUT1阴性 | 1 | 8 | |||
| 脑转移 | |||||
| GLUT1阳性 | 14 | 19 | 5.119 | 0.024 | |
| GLUT1阴性 | 1 | 12 | |||
低氧是实体瘤发展过程中的普遍现象，HIF-1α是一种核转录因子，调控着下游众多基因如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、内皮素-1、促红细胞生成素等的转录和表达，是低氧诱导基因转录信息传递的最主要途径[9]。在缺氧的情况下，HIF-1α表达急剧升高，激活GLUT1 5'端的增强子序列，从而引起GLUT1 mRNA的表达及其蛋白的合成[10]。在肿瘤缺氧过程中，HIF-1α参与调节肿瘤细胞糖代谢的基因，从而改变肿瘤微环境，进一步促进肿瘤的生长与转移[11]。研究证实，通过抑制糖酵解，可以有效清除在缺氧微环境中对化疗药物耐药的肿瘤细胞[12]。随着研究的深入，以HIF-1α/GLUT1为靶点的研究为肿瘤的预防及治疗开辟了新的途径。
肺腺癌脑转移部位多位于大脑半球，绝大部分患者的脑转移部位与脑实质的血管分布及血流量有关，转移灶通常处于大脑中动脉分布区、灰白质交界处。本组病例中47.8 %（22/46）的肺腺癌脑转移患者组织学上表现为乳头为主型腺癌。有研究指出，腺癌是影响脑转移患者预后的独立因素之一，此类患者治疗后的生存期通常较短，这可能与患者对治疗的耐受性较差有关[13]。本研究结果未发现肺腺癌脑转移与性别之间的关系，这与多数研究的结果基本一致[6]。
本研究发现，HIF-1α在正常组织中无表达，而在肺腺癌组织中表达率较高，肺腺癌转移组HIF-1α的阳性表达率高于肺腺癌未转移组，提示细胞持续缺氧可促进肿瘤的发生与转移。有体外实验显示，在5 %的氧含量时HIF-1α被激活，当氧浓度降低到0.1 %~0.2 %，其活性逐渐增加，在无氧时消失。肿瘤细胞通过高表达HIF-1α对其下游基因进行调控，以适应低氧环境，促进肿瘤生长转移[14]。Berghoff等[15]也发现HIF-1α的表达与非小细胞肺癌脑转移密切相关，与我们的结论基本一致。同时，本研究表明HIF-1α的蛋白表达与患者年龄相关，≥60岁组HIF-1α的阳性表达率明显高于<60岁组，提示HIF-1α的蛋白表达可能与衰老相关。Gomes等[16]以不同模型进行研究发现，HIF-1α可以切断细胞内线粒体和细胞核之间的通讯，会加速衰老，并且促进肿瘤的发生，提示年龄可能是癌症最大的风险因子。有Meta分析显示，在非小细胞肺癌中HIF-1α高表达提示预后不良[17]。因此，HIF-1α在肺腺癌的发生、发展中起着重要作用。
在缺氧状态下，组织主要通过无氧糖酵解来满足肿瘤生长需要的大量能量，其中GLUT1表达异常升高可能是癌细胞摄取葡萄糖增多的机制之一。GLUT1是体内分布最广泛、对机体内环境变化反应最敏感、分布最广的葡萄糖转运体，负责组织细胞的糖需求。GLUT1不仅能反映机体肿瘤良恶性、增殖程度及侵袭转移等特征，还可对肿瘤的分期、分级及预期治疗结果等进行客观评价。有研究表明，恶性肿瘤如脑肿瘤、胃癌、肺癌、妇科肿瘤等组织中GLUT1均呈高表达[2,4,18]。GLUT1在人肺癌组织中高表达，并且与预后密切相关[19]。国内王昆等[20]的研究也发现GLUT1蛋白在肺肿瘤组织中广泛表达，腺癌表达率为58 %。本研究发现GLUT1在肿瘤周围的正常肺泡上皮细胞中不表达，在未转移肺腺癌组织的表达阳性率为43.9 %，在淋巴结转移组和脑转移组的阳性表达率高达76.3 %，GLUT1蛋白阳性率与肿瘤淋巴结转移及脑转移密切相关。因此，GLUT1在肺腺癌淋巴结转移、脑转移中发挥重要作用。
总之，本研究结果表明HIF-1α与GLUT1蛋白表达与肺腺癌的转移密切相关。随着研究的深入，二者有望成为肺腺癌诊治的新靶点。
无
