随着对甲胎蛋白（AFP）与淋巴免疫调节、抑癌蛋白因子及干细胞性因子作用的深入研究，人们发现AFP参与了肿瘤发生、生长、转移，并维持肝癌干细胞功能。AFP可以通过抑制淋巴系统，抑制自然杀伤（NK）细胞活性，导致肝癌细胞逃避免疫监控；还可以抑制caspase-3、pten、p53等抑癌基因和抑癌蛋白的活性，通过激活癌干细胞因子的表达，促进肝癌干细胞形成，并维持其稳定。现对AFP调控肝癌细胞逃避免疫监控，抑制凋亡发生，促进肝癌干细胞生成的生物学功能进行综述。
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肝细胞癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升[1]，HCC易发生转移，发现时大部分患者已处于中晚期，仅1/3患者有机会得到手术治疗[2]，超过70%的HCC患者可检测到甲胎蛋白（AFP）表达。在健康成人中，血清AFP浓度约为5~10 μg/L。在肝细胞恶性转化早期，细胞中AFP基因被特异性激活表达，因其在肝癌中表达的高度特异性，临床上已成为协助HCC诊断的标志物，并作为肝癌治疗效果的参考[3,4,5]。AFP在肝癌发生过程中的作用机制并不完全清楚，现有研究表明AFP在肝细胞恶性转化过程中通过抑制免疫细胞功能、抑制抑癌基因表达和相关蛋白的功能，激活癌干细胞基因表达、调节细胞内部及周围的微环境（如细胞黏性、新生血管形成等），为癌细胞的生成和逃避免疫监控提供条件，从而诱导肝癌发生[6,7]。文章对AFP促使癌细胞逃避免疫监控，抑制细胞凋亡，促进肝癌干细胞生成等方面进行阐述。
AFP是胎儿和新生儿血清中正常组分，对胸腺源性T淋巴细胞功能具有靶向选择性抑制作用，包括T细胞介导的细胞毒性免疫反应等。Li等[8]发现AFP可抑制Jurkat细胞株中Fas配体（FasL）mRNA和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）mRNA的表达，导致FasL和TRAIL蛋白的表达下降，从而降低淋巴细胞对肝癌细胞的免疫抑制作用。Laderoute[9]发现AFP作为成熟的免疫抑制因子通过AFP受体（AFPr）阻止巨噬细胞诱导的细胞裂解，促使肝癌细胞逃脱淋巴细胞的免疫监视。
Vujanovic等[10]在体外培养的自然杀伤（NK）细胞中添加肿瘤来源性AFP（tAFP）和人脐带血中AFP（nAFP），发现两种蛋白对NK细胞的影响不同。nAFP诱导独特的促炎症反应，通过上调NK细胞分泌白细胞介素（IL）-2、IL-1β、IL-6、CD69和肿瘤坏死因子（TNF）增强对肿瘤细胞的杀伤作用，而tAFP负面影响NK细胞的活力。Um等[11]发现AFP不仅可诱导树突状细胞（DC）功能障碍，下调CD40、CD86、IL-12和TNF-α蛋白分子表达；AFP也可诱导DC明显凋亡，以此有效阻碍抗肿瘤免疫应答；同时临床发现在高表达AFP的HCC患者中离体培养AFP-DC产生的TNF-α比在健康人中离体培养的AFP-DC产生的TNF-α蛋白表达量要少。Yamamoto等[12]在与NK细胞共培养中发现DC的可溶性因子具有抑制AFP-DC激活NK细胞的作用，且在AFP-DC中IL-12p35和IL-12p40 mRNA显著抑制，即IL-12蛋白的表达受到抑制；在添加IL-12后NK细胞的细胞溶解活性增加，即AFP-DC对IL-12表达产生的抑制，导致DC对NK细胞的活化能力减弱。提示AFP可通过作用于IL-12诱导DC功能障碍进而影响机体免疫。在抗原呈递DC中表达AFP片段后，刺激T淋巴细胞产生针对HCC的免疫应答，明显抑制肿瘤细胞的生长[13,14]。同样，Lu等[15]在HCC小鼠模型中，发现来源于DC表达的外泌体AFP（DEX AFP）可以引发强烈的抗原特异性免疫反应，导致HCC荷瘤小鼠的肿瘤生长迟缓，并延长存活率。在无胸腺的小鼠中，T细胞有助于DEX AFP介导的抗肿瘤功能，即DEX AFP可以触发有效的抗原特异性的抗肿瘤免疫应答。提示由DC表达分泌的AFP生物活性有别于肿瘤细胞分泌的AFP，进一步提示蛋白所处的微环境对蛋白功能具有决定性的影响。
PTEN作为抑癌基因参与诱导细胞凋亡，大部分肝癌患者PTEN表达偏低、表达被抑制[16]。PTEN通过与PI3K亚基结合后，抑制PI3K磷酸化，使PIP3去磷酸化转变为PIP2，抑制AKT的磷酸化[17]，抑制癌细胞增殖。当PTEN基因突变或被抑制表达时，可引起P13K-AKT-mTOR通路的活化[18]，激活癌基因的表达。Gao等[19]发现AFP促进PTEN泛素化，抑制PTEN的磷酸酶功能，降低PTEN蛋白细胞水平；Ohkawa等[20]在胞质中添加AFP抗体，导致AFP显著减少。同时，PTEN丝氨酸的磷酸化和PTEN稳定性显著增加，PTEN表达量增加；当AFP表达被抑制时，也引起PTEN表达升高[18]。
Li等[21]发现AFP可与全反式维甲酸（ATRA）竞争直接结合维甲酸受体（RAR），形成RAR-AFP复合物，进而阻断ATRA-RAR复合物进入细胞核与PTEN基因的上游元件相互作用，从基因水平上抑制PTEN基因转录。有研究通过激光共聚焦发现在BEL7402、HepG2细胞中，AFP和PTEN在胞质中共定位；免疫共沉淀也发现AFP和PTEN形成免疫复合体，提示AFP与PTEN存在直接作用结合的可能[18,22]。AFP通过直接结合PTEN蛋白促进其泛素化和阻止PTEN的合成，从而降低细胞中的PTEN，提示当肝脏肿瘤发生时，PTEN不仅在蛋白水平生物活性受到抑制，其基因表达同样受到抑制。提示通过抑制AFP的表达和生物活性就可以促进PTEN功能的发挥，诱导癌细胞凋亡，因此抑制AFP可以作为增强PTEN活性的药物设计靶点。
在肝癌细胞中，p53可直接抑制AFP基因表达，也通过调控其他生物因子协同抑制AFP基因的表达。Ogden等[23]发现p53与AFP-DNA结合通过改变AFP核心启动子染色质结构抑制AFP转录。有研究发现在正常肝细胞中，Smad和SnoN与p53聚合并结合AFP的远端启动子，进而抑制AFP表达[24,25]；表达AFP的肝癌细胞中过表达转化生长因子（TGF）-β1激活SnoN转录和Smad2表达；在肝癌细胞中发现SnoN不仅抑制AFP的表达，更可促进mSin3A蛋白表达，p53可与激活的Smad蛋白和辅助阻遏物mSin3A聚合并结合AFP远端启动子进而抑制AFP表达；siRNA-SnoN、siRNA-p53敲低肝细胞中SnoN和p53表达导致AFP转录抑制解除。这些发现支持p53和TGF-β效应子、SnoN、Smad、mSin3A协同作用沉默AFP基因的表达。
Kataoka等[26]发现生长抑制因子1（ING1）通过作用于p53基因促使p53蛋白表达进抑制AFP表达，同时也发现ING1可直接与AFP-DNA结合抑制AFP基因转录，以此ING1协同p53抑制AFP基因的表达。p53家族包括p73和p53等成员，p73与p53共享调控ATP表达的调节位点，p73通过结合p53与AFP远端启动子相互作用的阻遏位点（-860/-830）还原乙酰化组蛋白H3赖氨酸9和增加二甲基化组蛋白H3赖氨酸9水平，通过改变染色质结构抑制AFP基因表达，其水平与p53相当，且敲除p53后可促进p73与染色质结合，以此p73协同p53共同抑制AFP基因表达[27]。同样，Ogden等[28]研究发现，在感染乙型肝炎病毒（HBV）后，由HBV诱导肝癌发生过程中，由HBV表达的HBx蛋白不仅直接激活AFP的表达，HBx因子还与p53通过蛋白质-蛋白质特异性相互作用改变p53结构，抑制p53的转录调节功能，阻遏p53与AFP基因启动子结合，导致AFP基因被激活。在表达AFP的人类肝癌细胞株加入抗人AFP抗体后发现p53蛋白增加，p53蛋白中丝氨酸第S20、S392磷酸化显著增加，同时PTEN参与这一过程，预示AFP抑制p53的生物活性，AFP抗体拮抗AFP后导致p53量的增加和活性增强，PTEN的参与不仅增强了p53活性，更能协同p53更好地发挥抑癌功能[29]。
caspase家族参与细胞凋亡过程[30,31]，活化后的caspase高度特异性识别剪切目的蛋白N端中天冬氨酸残基后的裂解位点，促使目的蛋白裂解成碎片段。在caspase家族促进细胞凋亡过程中caspase-3的作用尤为重要。我们通过免疫共沉淀和激光共聚焦发现caspase-3与AFP可相互作用形成复合物[32,33]，也证实AFP可与caspase-3直接相互作用，软件模拟caspase-3与AFP相互作用的位点后，通过定点突变试验发现AFP通过与caspase-3的loop-4残基Glu-248、Asp-253和His-257直接相互作用，从而抑制癌细胞凋亡。Li等[34]研究发现Bel 7402细胞中AFP与RAR-β相互作用后，通过抑制DR5表达，抑制TRAIL抗肿瘤功能；AFP敲除后，用TRAIL特异性提高的caspase-8活性后，可激活caspase-3表达而诱发细胞凋亡。Zhang等[35]发现AFP特异转移因子通过线粒体凋亡通路调控细胞色素C，从线粒体进入胞质激活caspase-9和caspase-3表达，从而诱发细胞凋亡。AFP-TF激活表达的caspase-3一部分可直接与AFP结合，使结合的AFP丧失生物活性，另一部分则激活凋亡信号通路，抑制AFP的生物表达。Yang等[36]研究发现在表达AFP的Huh7细胞中通过siRNA-AFP干扰AFP的表达后，导致bax/bcl-2比例增加，细胞色素C从线粒体释放，caspase-3被激活，可显著抑制肝癌细胞增殖，增加凋亡。
以上实验提示AFP不仅能够直接结合caspase-3，抑制caspase-3蛋白分子活性，还可以作用其他蛋白因子抑制caspase-3的基因表达。在原先表达AFP的细胞中干扰抑制AFP表达后，可以促进caspase-3的表达升高；在当p53-bax-细胞色素C-caspase-3信号通路出现功能障碍时，AFP蛋白表达增加，增强了细胞的凋亡抵抗性。提示细胞内AFP与可能处在一个动态平衡中，当这种平衡被打乱，AFP蛋白表达提升时，引起细胞的凋亡被抑制及细胞恶性转化。
在肝癌中发现，肝癌干细胞能够自我增殖、分化产生不同阶段、不同生物学行为的肝癌细胞群体[37]。与大多数癌干细胞（CSC）一样，肝癌干细胞也表达CD133、EpCAM、CD44、Oct4、Sox2、NANOG、C-MYC、Klf4、c-myc等干细胞标志物。Zhu等[38]在临床病理标本中发现重编程因子CD44、CD133、EpCAM、Oct4、Klf4、Sox2和c-myc的表达量与AFP（+）/HBV（+）HCC组织呈正相关。AFP可以通过PI3K调控AKT蛋白分子表达和活性，进而调控细胞重编程因子表达和活性，如AFP可以激活磷酸化的AKT后激活OCT4、EpCAM、CD44、CD133表达[39]；Toraih等[40]发现磷酸化后的AKT可以诱导Oct4磷酸化并促进磷酸的Oct4与干细胞性因子Sox2相互作用。AKT也可直接与Sox2相互作用[41]；同时，AKT与Nanog在mRNA水平和蛋白质水平表现出正相关[42]；AKT激活β-catenin入核诱导c-myc启动子活化，促进c-myc转录表达[43]。
Arzumanyan等[44]通过分析稳定转染HBx的HepG2细胞，发现HBx激活AFP表达后可以通过Wnt-β-catenin通路引起干细胞表面标志物EpCAM、Oct-4、Nanog、Klf-4、Myc表达升高并促进肝癌干细胞形成。Yamashita等[45]研究结果也表明Wnt-beta-catenin信号通路激活后导致EpCAM高表达。因此，提示AFP通过Wnt/beta-catenin通路影响EpCAM表达。Yamashita等[46]发现EpCAM阳性HCC表现出肝癌干细胞样的性状，并指出EpCAM阳性肝癌细胞集决定HCC的生长和侵袭性。EpCAM协同CD90促进肝癌进展及维持肝癌干细胞特性。有趣的是Clinkenbeard等[47]发现β-catenin减少时，围产期肝脏中的内源性AFP mRNA水平减低，以此提示β-catenin可能在基因转录水平上影响AFP的表达。提示AFP与β-catenin之间存在动态平衡，并且β-catenin可以反过来调控AFP的表达。HBV感染肝细胞后表达IL-6，可诱导肝细胞转变为肝干细胞[48]；Frampton等[49]发现IL-6表达受PI3K-AKT信号通路调控。以上提示AFP可以调控IL-6的表达。我们实验室已证实HBV表达的HBx优先驱动AFP表达，综合上述即形成了HBV-HBx-AFP-PI3K/AKT-IL-6这一通路。
AFP在肝癌发生过程中的分子作用机制未完全清楚，随着对AFP探索，其诱导肝癌发生的生物学功能逐渐被发现，然而AFP促进肝癌细胞恶性转化的作用，为何未在胚胎时期发生，是否存在相应的抑制传导通路或者特异性受体拮抗物质却不清楚。对于肿瘤来源的AFP和DC来源的AFP表现出不同的生物学性状，说明外界环境对AFP表达后空间结构形成存在影响，到底影响哪些结构还是未知，如果发现两者来源的不同结构特异性设计肿瘤来源的AFP抑制剂将更加有利于肿瘤的免疫治疗。表达的AFP通过直接或者间接从基因表达和蛋白水平抑制PTEN、p53、caspase表达和生物活性，表现出抗凋亡的特性。AFP与caspase-3结合作用位点已被解析出来，而与PTEN的作用位点我们实验室也正在解析中，至于AFP是否像caspase-3、PTEN一样与p53存在直接结合有待进一步验证。AFP通过激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等信号通路，调控表达Ras、Src、CXCR4、Oct4、SOX2、NANOG和C-MYC等重编程因子而发挥细胞重编程作用；而AFP通过与RAR、PTEN、p53和caspase-3等相互作用抑制其生物活性，表现出抑制凋亡、促增殖、促转移、维持癌干细胞特性等生物活性。另外，IL-6、AFP与肝癌干细胞存在着密切联系，共同维持促进肝癌发生过程，而IL-6如何协同AFP诱导肝干细胞转变成肝癌干细胞还需进一步阐明。
所有作者均声明不存在利益冲突
