应用小动物活体成像系统Spectrum-CT对3种不同方式建立的人肺肿瘤裸鼠原位移植瘤模型进行实时监测和生物学特性比较，为肺癌研究提供更有价值的实验动物模型。
构建稳定表达荧光素酶的人肺癌A549细胞株（A549-Luc），应用胸腔注射法、尾静脉注射法和气管灌流法将A549-Luc细胞分别接种于裸鼠（每组6只），建立人肺癌原位移植瘤模型。应用Spectrum-CT活体成像系统对3组模型鼠进行生物发光成像，监测肿瘤组织的生长情况和荧光信号强度，每周1次，连续监测4周，最后解剖裸鼠肺组织进行体外发光成像和病理学分析。
生物发光成像分析结果显示，3种模型鼠移植瘤组织均持续生长，建模第4周，胸腔注射组模型鼠的荧光信号强度值[（2.78±0.18）×106 P/s]强于气管灌流组[（1.45±0.20）×106 P/s]和尾静脉注射组[（1.35±0.14）×106 P/s]（F=62.53，P<0.01）；3D活体成像分析显示，3组模型鼠肺癌移植瘤组织呈不同的生长状态，胸腔注射法模型鼠呈右侧肺叶接种位点处单点肿瘤灶生长，气管灌流法模型鼠肿瘤灶呈左右两侧肺叶不确定多点生长模式，尾静脉注射法模型鼠肿瘤灶相对较为均匀地分布在左右两侧肺叶上。
与气管灌流法和尾静脉注射法模型鼠比较，胸腔注射法原位肺肿瘤模型成瘤更快，在开展移植瘤主动定位研究方面存在优势；结合使用Spectrum-CT活体成像系统，在原位肺肿瘤模型建立的早期阶段就可以对移植瘤组织的生长情况进行实时定位和定量分析，可为肺癌发病机制和药学研究提供有价值的实验材料。
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肺癌发病机制的相关研究、新型疗法的有效性和预防性研究都需要准确且容易获得的实验动物模型。常用的肺癌皮下异种移植瘤模型容易建立，但缺乏相应的机体环境和肿瘤微环境，临床试验获得假阴性药效结果的比例较高[1]。而肺癌原位移植瘤模型的建立在模拟肺癌自然发病史的同时，也更利于抗肿瘤药物的筛选[2]。生物发光成像是高度敏感、无创的成像方式，可实时监测位于深部器官组织的肿瘤灶的发生与发展情况[3,4,5]。小动物活体成像系统Spectrum-CT实现了生物发光技术和CT的联用，从而更有效地用于原位移植瘤模型的研究。本研究构建稳定表达萤火虫荧光素酶基因的人肺癌细胞株，采用3种方式（胸腔注射法、气管灌流法和尾静脉注射法）建立裸鼠肺癌原位移植瘤模型，应用Spectrum-CT系统对模型鼠进行2D和3D生物发光成像，实时观察荷瘤组织的生长和进展情况，比较3种模型的优缺点，为深入开展肺癌发病机制和诊疗相关性研究提供可靠的实验材料。
BALB/c裸鼠，18只，雄性，体质量17~19 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SYXK（京）2016-0006]，于北京大学肿瘤医院实验动物室[许可证号：SYXK（京）2016-0015]屏障环境中饲养，饲养温度（22±2）℃，相对湿度40%~60%，每12 h明暗交替照明，给予充足的饲料和高压无菌水。所有在动物水平开展的实验操作和饲养管理均经过北京大学肿瘤医院实验动物管理委员会和伦理委员会批准。
细胞培养皿（100 mm）和细胞96孔板购于美国Corning公司，RPMI 1640培养液、胎牛血清（FBS）、双抗、胰蛋白酶、遗传霉素G418购自美国Gibco公司，人源肺癌细胞株A549和携带有荧光素酶基因的病毒质粒由北京大学肿瘤医院细胞生物学研究室保存并提供，0.4%锥虫蓝染液购自中国索莱宝公司，荧光素酶钾盐底物购自美国PE公司，戊巴比妥钠购自中国国药集团，异氟烷购自河北一品制药有限公司。CO2细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司，小动物活体成像Spectrum-CT仪购自美国PE公司。
取生长状态良好的A549细胞（细胞融合度为30%~40%），加入含有萤火虫荧光素酶基因的病毒质粒，放入培养箱中培养。观察细胞生长情况，待其融合度增长至80%~90%时，加入含500 μg/ml G418的RPMI 1640培养液（G418完全培养液），对细胞进行筛选。观察细胞死亡情况，每2 d进行换G418完全培养液，至14 d后或细胞未出现大量死亡为止，获得稳定表达荧光素酶基因的A549细胞株，命名为A549-Luc。
将生长状态良好的A549-Luc细胞用胰蛋白酶消化，分别取0、50、100、500、1 000、5 000、1×104、5×104、1×105、5×105、1×106个细胞，分别接种于96孔板中，100 μl/孔，每个浓度设2个复孔，加入20 mg/ml荧光素酶钾盐底物100 μl，反应15 min，应用Spectrum-CT仪测定各孔细胞荧光强度，分析细胞数与荧光强度的相关性。
培养A549-Luc细胞，待细胞处于生长对数期时，消化收集细胞，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并清洗细胞，细胞计数仪计数，加入等体积的细胞基质胶，然后调整细胞密度为2×107/ml。取6只裸鼠，用1.5%的戊巴比妥钠按照裸鼠体质量50 mg/kg进行麻醉，采取仰卧位固定裸鼠，用75%乙醇棉球擦拭裸鼠的右侧前胸部位，可见粉色的肺部充实胸腔。用胰岛素注射器吸取50 μl A549-Luc细胞，在细胞混合液处于半凝固状态时，于裸鼠右侧肋弓上1.0~1.5 cm处，垂直体表进针，约3 mm，缓慢注入细胞，停针数秒后拔出针头。
消化A549-Luc细胞，调节细胞密度为2×107/ml。取6只裸鼠，抓取裸鼠进行麻醉（同胸腔注射法）。待裸鼠麻醉后仰卧45°固定，用气管导管针进行气管插管，待导管针进入气管后，将50 μl A549-Luc细胞缓慢注入气管中，停针数秒钟后，将裸鼠垂直悬挂15 min，然后放回饲养盒中。
消化A549-Luc细胞，调节细胞密度为5×106/ml。取6只裸鼠，固定其尾巴，用75%乙醇进行消毒，使其尾血管充盈，每只裸鼠尾静脉注射200 μl A549-Luc细胞悬液，注射完成后按压止血。
定期对裸鼠通过腹腔注射20 mg/ml荧光素酶钾盐底物，每只裸鼠150 μl，采用异氟烷麻醉裸鼠，15 min后选择生物发光系统对裸鼠进行成像，每周1次，连续跟踪监测4周。参数设定如下：Exposure time=Auto，Binning factor=8，F/stop=2，Excitation filter=block，Emission filter=open；应用2D成像后依据感兴趣区（ROI）测量肿瘤区域的荧光信号；应用3D成像确定肺原位肿瘤的精确定位，从图像的冠状面、矢状面和横截面的成像结果来综合判断信号源的精确定位信息。
模型鼠腹腔注射荧光素酶底物，10 min后迅速解剖裸鼠取出肺脏，5 min后置于成像底板上进行生物发光成像，条件与2D活体成像一致。
待成像实验结束后，将模型鼠肺部组织置于4%甲醛固定液中固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色，观察拍照。
采用GraphPad Prism6统计学软件。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用线性回归法。P<0.05为差异有统计学意义。
应用活体成像Spectrum-CT测定，经过G418筛选的A549-Luc细胞与荧光素酶底物发生酶促反应，产生自发荧光，且细胞数目与相应的生物发光值呈正相关（R 2=0.996 2），提示萤火虫荧光素酶报告基因已成功转入A549细胞并稳定表达，即A549-Luc细胞株构建成功。
3组模型鼠肺脏原位接种A549-Luc细胞后1周内，胸腔注射组模型鼠6只均存活，气管灌流组模型鼠存活4只，尾静脉注射组模型鼠6只均存活。3组模型肿瘤部位的荧光信号强度值均随着细胞接种后时间的延长而增强（图1），显示3组模型鼠的荷瘤组织均在持续生长。各组在4个观察时间点肿瘤部位荧光强度差异均有统计学意义（表1）；在建模第4周时，胸腔注射组模型鼠的荧光信号强度值高于气管灌流组（t=8.652，P<0.05）和尾静脉注射组（t=10.768，P<0.05），后两组之间差异无统计学意义（t=0.674，P>0.05）。
活体成像系统Spectrum-CT观察胸腔注射组、尾静脉注射组和气管灌流组肺癌原位移植瘤模型裸鼠荷瘤组织不同时间点生物发光成像荧光信号强度值比较（
±s，×106 P/s）
活体成像系统Spectrum-CT观察胸腔注射组、尾静脉注射组和气管灌流组肺癌原位移植瘤模型裸鼠荷瘤组织不同时间点生物发光成像荧光信号强度值比较（±s，×106 P/s）
| 组别 | 只数 | 第1周 | 第2周 | 第3周 | 第4周 |
|---|---|---|---|---|---|
| 胸腔注射组 | 6 | 0.65±0.10 | 0.88±0.20 | 1.77±0.11 | 2.78±0.18 |
| 气管灌流组 | 6 | 0.23±0.10 | 0.66±0.05 | 0.94±0.08 | 1.45±0.20 |
| 尾静脉注射组 | 6 | 0.23±0.02 | 0.39±0.06 | 0.87±0.05 | 1.35±0.14 |
| F值 | 26.17 | 11.98 | 101.1 | 62.53 | |
| P值 | 0.001 | 0.008 | <0.01 | <0.01 |
3D成像显示，3种模型鼠肺部肿瘤组织呈不同的生长状态。胸腔注射法模型鼠呈右侧肺叶上单点肿瘤灶生长（图2）；气管灌流法模型鼠肿瘤灶呈不确定多点生长模式，肿瘤灶分布在左右两侧不同的肺叶上（图3），是由接种时肿瘤细胞随肺呼吸的气体随机流动造成的；尾静脉注射法模型中，细胞接种后随血液循环较为均匀地分布在左右两侧肺叶上（图4），是由血液对肿瘤细胞的运输所致。
离体组织生物发光成像显示，在小鼠肺脏可见清晰的肿瘤组织（图5A、图6A、图7A）。离体肺脏大体观察显示，胸腔注射组的肿瘤组织呈单一肿瘤灶，气管灌流组呈不确定位置多个肿瘤灶，而尾静脉注射组的肿瘤灶弥散分布在左右两侧肺组织中（图5B、图6B、图7B），肿瘤组织在肺中的分布与生物发光成像分布相吻合。病理学检测结果清晰展示肿瘤组织和正常肺组织（图5C、图6C、图7C）。
注：箭头所指为肿瘤组织
注：箭头所指为肿瘤组织
注：箭头所指为肿瘤组织
随着肺癌发病率和致死率的逐年增长，当前迫切需要对肺癌发病机制、早期诊断以及治疗进行研究。建立理想的、易行的、高度模拟人肺癌疾病发生学特征和疾病进展过程的动物原位模型对于深入开展肺癌相关研究具有重要意义[6]。
伴随着原位模型在肺癌相关研究中的广泛应用，活体成像技术也随之不断发展成熟，目前荧光发光和生物发光成像、CT、磁共振成像（MRI）和PET-CT等[7,8,9]成像技术已被应用到肿瘤的研究中，而不同成像技术的联合应用更具优势。本研究采用生物发光成像和CT成像技术相结合的方法，利用荧光素酶和荧光素酶底物的酶促反应原理产生自发光，产生特异性组织穿透性强的光信号，加之与CT扫描技术的联用，可以准确定位肿瘤的原发部位，通过3D重建技术更清晰展示出原位模型的发生和发展过程，为实验研究提供更精准的定位和定量依据[10,11,12]。
非荧光标记的原位模型在实验研究中存在着明显不足，对其常规的监测方法是定期处死部分模型动物，采用病理切片的方法对模型样本进行评估，对模型的荷瘤组织不能进行有效的实时监测，缺乏实验的连贯性和整体性[13]。本研究应用自行筛选的稳定表达荧光素酶基因的人肺癌细胞构建了3种裸鼠肺癌原位移植瘤模型，进一步应用Spectrum-CT系统对肺癌原位移植瘤模型裸鼠进行非侵入式无创活体成像观察，并对同一模型裸鼠进行定期活体跟踪监测，实时记录信号源的连续性荧光强度数据。本研究获得的荧光信号强度数据与肿瘤细胞的数量成正比，同时还可以应用软件比较不同时间点的检测数据，结果更直观可靠。本实验结果显示，尾静脉注射法建模的成瘤率高，模型建立成功后活体生物发光成像结果显示，受血液循环的影响，肿瘤结节弥漫性分布于活体鼠肺脏的多个区域，难以模拟肺癌患者早期局部病灶的发生、发展、转移的整个病变过程。裸鼠尾静脉接种肿瘤细胞数较多或接种操作过快时容易诱导肺栓塞，导致动物死亡[14]。气管灌流法成瘤率相对偏低，而且该方法对于裸鼠气管插管的技术操作要求较高，受肺呼吸气流的影响，肿瘤灶在裸鼠左右两侧肺叶的分布上也呈现明显的随机性。与上述两种模型比较，胸腔注射法肺癌原位移植瘤模型具有高成瘤性的特点，而且该方法有效降低了血液循环和肺呼吸的干扰，使肿瘤细胞集中于接种区域生长，从而实现快速建模；该方法可以将设定数量的肿瘤细胞注入靶器官的特定区域，在开展移植瘤主动定位研究（如研发肿瘤早期诊断的特异性探针和抗肿瘤治疗的靶向性药物）时推荐采用该模型；同时，该方法也可提供适当的肿瘤生长微环境。开展活体成像分析需要考虑接种肿瘤细胞的确切位置、各实验组间和组内相对一致的肿瘤区域范围大小以及荷瘤组织与相对正常癌旁组织的对比研究等因素。与其他两种模型比较，在胸腔注射肺癌原位模型应用CT和光学成像等技术监测更具优势[15,16]。而且，在以往2D成像的基础上，Spectrum-CT系统进一步实现3D成像，对深部脏器组织的微小肿瘤病灶进行成像分析[17]，为后续相关实验提供可靠的实验依据。
综上所述，本研究应用自行构建的稳定表达荧光素酶基因的人肺癌A549细胞成功建立了裸鼠肺癌原位移植瘤模型，进一步结合Spectrum-CT系统开展2D和3D活体成像分析，对肿瘤细胞在动物活体深层脏器组织中的生长情况进行实时定位和定量分析。通过对3种不同肺癌原位移植瘤模型的比较，发现经胸腔注射法建立的肺癌原位模型在成瘤率、成瘤周期以及荷瘤组织精准定位方面较其他两种建模方式更具优势。而且，肺癌原位模型结合使用非侵入性光学成像技术来评估荷瘤组织的发生发展情况，在实现实时跟踪监测以获得更准确实验数据的同时，也更符合实验动物福利伦理要求，为肺癌发病机制和药学研究提供了非常有价值的实验材料。
所有作者均声明不存在利益冲突
