生物样本库为临床和基础研究提供了丰富的样本资源，相关研究取得的成果可以服务于患者的治疗，加快了基础研究和应用转化的速度。目前，针对肿瘤样本的处理和储存条件对样本质量的影响展开了广泛的研究，但结果差异较大。国内外多项研究表明肿瘤样本的储存时间及温度是影响样本质量的关键因素，但是缺乏系统性综述。文章主要综述肿瘤样本采集和储存过程中时间及温度对血液和肿瘤组织样本RNA、DNA和蛋白质质量的影响。
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目前，生物样本库每年储存数量巨大的生物样本，样本质量控制是保证生物样本稳定性和有效性的重要手段。其中，血液和组织样本的质量不仅取决于生物样本的处理流程，而且取决于储存条件，特别是储存温度和时间。组织样本留取的处理过程包括热缺血和冷缺血两个主要过程，对于不同成分的最佳长期储存（≥6个月）条件是值得讨论的问题，也是样本收集标准流程中的关键点。目前许多中心在-80 ℃下储存，有学者建议选择液氮或-137 ℃更好[1]。因为各种储存方法所报道的质量结果并不一致，因此，本文针对血液和组织样本，综述了处理和储存过程的重要指标时间及温度对样本RNA、DNA和蛋白质质量的影响。
一项关于结肠样本的研究显示室温4 h对RNA完整度（RIN）无影响，在室温下保存24 h的样品中RIN无显著变化（<10%）[2]。但其他研究得出相反结论，例如，Sun等[3]研究表明在室温下1 h后肾癌组织中RNA有轻微的降解。也有研究比较了在术中暴露前列腺原位与切除后离体组织的基因表达谱，结果显示9%癌症相关基因mRNA表达水平增加至少2倍，但28S/18S的比例未受影响[4]。基因组测序技术日渐成熟和高效，这使得针对肿瘤组织以及外周血的二代测序（NGS）越来越多地用于研究几乎所有类型的恶性肿瘤[5]。收集用于NGS测定（RIN≥8）的高质量RNA样品的室温储存持续时间应控制在24 h内[6]。比较开胸手术时和切除后立即采集的肺癌标本，1%的基因差异超过2倍[7]。在室温下保存1个月的血液样本中可以提取到足够产量和质量的DNA[8]。DNA甲基化作为常见的表观遗传学事件之一，在肿瘤的诊断及治疗中发挥关键作用[9]。然而，在研究中发现，全血室温储存持续时间超过3 d DNA甲基化显著改变[6]。Khoury等[10]证实室温下2 h雌激素受体（ER）免疫染色评分下降3%，4 h下降9%，8 h下降20%；室温下4 h孕激素受体（PR）免疫染色评分下降11%，8 h下降15%。
结肠样本在4 ℃下储存4 h对RIN无影响，在干冰（约4 ℃）下保存24 h的样品中RIN无显著变化（<10%）[2]。但其他一些研究得出相反结论，认为随着组织在4 ℃下储存时间的增加RIN逐渐降低。研究认为处理时间在24 h内是可行的，且4℃下储存不影响DNA质量[11]。在4 ℃下保存1个月的血液样本中可以提取到足够产量和质量的DNA[8]。此外，储存20年的DNA或血液样品中确定的基因组区域甲基化谱在所有储存温度（包括4 ℃）中是相似的。储存样本中的DNA水平与最近收集样本中的DNA水平无显著差异[12]。Khoury等[10]证实血液样品在室温或4 ℃下超过24 h可能会导致蛋白质变化。然而，Apple等[13]认为肿瘤ER和PR状态在4 ℃下保存4 d后才发生改变。
对于长期储存，Zeisler等[14]证实人类肝脏标本在-25 ℃条件下储存7年后RNA明显降解，并且组织中肿瘤细胞占比越高其RIN越高[15,16]。在-20 ℃下保存1个月的血液样本中可以提取到足够产量和质量的DNA[8]。Qvist等[17]证实血液样本在-20 ℃下储存3年其骨吸收标志物Ⅰ型胶原C-端肽（CTX）保持稳定。Kisand等[18]报道在-20 ℃下保存的血清中血管内皮生长因子（VEGF）水平急剧下降。但是，另一种血清成分基质金属蛋白酶7（MMP-7）在-20 ℃下保存5年后保持稳定。
Zeisler等[14]证实储存在-80 ℃下和-150 ℃下的肝脏标本RNA无明显变化[15,16]。RIN分析表明样本长期储存RNA会发生逐渐的降解，但是这种降解程度足以用于大多数的反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析[19]。DNA在超低温下冷冻时几乎不发生变化，甚至在纸上保存数年后仍然稳定。液氮中的快速冷冻（<5 min）似乎有利于磷酸化状态保持，Walker等[20]发现在液氮中立即冷冻的样品肌钙蛋白磷酸化增加，而保留在停搏液中的组织肌钙蛋白和肌球蛋白轻链磷酸化降低。Kisand等[18]报道在-75 ℃保存的血清中VEGF水平急剧下降。但是，另一种血清成分MMP-7在-75 ℃下长期保存也基本稳定。而MMP-9在-80 ℃下储存2年后水平降至原来的65%，3.5年后降至原来的1%[21]。Qvist等[17]证实血液样本在不同温度下（-80℃和-150 ℃）储存3年后CTX均能保持稳定。有趣的是，在低温储存过程中一些分析物浓度随时间延长而增加。例如，Potter等[22]表明血清在-80 ℃下储存2年或更长时间后多肽和细胞因子浓度随着储存时间的增加而增加。
热缺血是指在手术期间组织的脉管系统受到损害时供血停止，在体温下较活跃的酶开始降解特定分子，并且手术后在组织中一些不稳定的分子可能很快就检测不到。这一期间血流中断，氧和各种代谢底物供应缺乏，而组织的代谢水平仍然较高，对组织的损害最为严重[23]。手术过程中热缺血时间长短经常难以追踪，所以一些中心在进行主要切除术之前由生物标本库的技术人员携带液氮罐进入手术室，在术前获取活组织检查样本。冷缺血是指组织切除后但在长期保存之前需冷却的环境，将组织保存在冰上的时期[24]。冷缺血可影响基因和蛋白质的表达。肺癌中5%基因的表达水平在延迟30 min后改变至少2倍[7]。而乳腺癌中改变的基因数量随着处理延迟时间的增加而增加，从延迟2 h的0.76%增加到延迟24 h后的4.1%[25]。通常情况下，缺血15 min或更短的时间内有些分子如应激/炎症因子会增加。冷缺血2 h后，乳腺癌样品中PR的免疫组织化学染色显著减少[26]。总之，目前仍没有确定的冷缺血最佳时间。多数的研究推荐冷缺血时间和标本处理过程保持在30 min内，但考虑到手术标本在切除后需要一些程序如：给患者家属查看、留够组织做病理检查等，30 min内冻存比较困难，建议最多不要超出1 h。标本的离体时间越短越好，尽快将标本进行处理保存是影响标本质量的关键。
随着转化医学的迅猛发展，高质量的生物样本在医学研究中发挥越来越重要的作用。生物样本库的合理化建设、样本的高效储存、样本信息的可持续性应用都将很大程度的影响着生物医学的发展，但在这个过程中也存在着诸多问题。
目前，生物样本库的主要问题是缺乏统一的操作标准和完善的数据库信息化建设。各种组织的分子稳定性方面存在限制，RNA、DNA和蛋白质等每种分子在各种不同保存条件下有特定分子的变化。诸多研究提示转化实验结论的不一致可能与标本的留取和储存过程没有统一标准有关。因此，我们建议：（1）组织样本在离体30 min内分装成多个小份冻存，可以避免后续多次取样和反复冻融对标本质量的影响；（2）增加标本储存冰箱的独立分区，减少温度波动的影响；（3）从标本离体、储存、每次冻融等均进行登记具体时间及温度，以此实现对标本的全程跟踪监测；（4）具有资质的生物样本库专业人员应该为样本处理人员及生物样本使用者提供统一的、标准化培训和指导；（5）为避免冷/热缺血对基因表达谱的影响，建议术前采集生物样本作为最佳方法；（6）新鲜组织在存入生物样本库之前可以在冰上运输以避免造成RNA质量的显著降低；（7）为确保从样本中提取高质量的RNA，建议将组织放于装有RNA later的冻存管中，再转移到-80 ℃下保存[27]；（8）Kakimoto等[28]使用NGS分析发现中性甲醛溶液固定石蜡包埋组织与新鲜冷冻样品中miRNA的稳定性差异明显。但也有研究证实，固定时间对整体miRNA表达水平没有显著影响[29]，这方面仍需更深入的研究。因此，为保证生物样本质量，在处理样本的过程中应根据样本库的实际情况制定并执行相应的标准操作程序。
所有作者均声明不存在利益冲突
