马志方; 曾胜; 郐海洋; 杭天昆; 刘春

doi:10.3760/cma.j.cn115355-20200306-00096

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雄激素受体对从前列腺癌LNCaP细胞分选出的CK5⁺CK8⁺细胞的作用及其调控机制

肿瘤研究与临床, 2021,33(1) : 42-47. DOI: 10.3760/cma.j.cn115355-20200306-00096

摘要

目的

探讨雄激素受体（AR）对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞的作用及其调控机制。

方法

采用流式细胞术从LNCaP细胞中分选CK5⁺CK8⁺细胞，使用慢病毒载体携带AR基因转入CK5⁺CK8⁺细胞。实验分为转入AR的AR CK5⁺CK8⁺组和转入空载体的V CK5⁺CK8⁺组，在1、10 nmol／L二氢睾酮（DHT）培养条件下，采用蛋白质印迹法检测AR、p-AKT和bcl-2蛋白的表达，应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、细胞迁移实验和琼脂糖凝胶克隆形成实验检测AR对CK5⁺CK8⁺细胞生物学特性的影响。采用MTT法检测应用AKT信号通路活化抑制物LY 294002（LY）、γ-生育三烯酚（γ-TT）和（或）诱导AR表达的5-氮胞嘧啶（5-AZA）对CK5⁺CK8⁺细胞增殖的影响。

结果

AR基因转入CK5⁺CK8⁺细胞后，AR表达增强，p-AKT和bcl-2蛋白表达水平降低。在1、10 nmol／L DHT作用2、4、6 d后，AR CK5⁺CK8⁺组细胞较V CK5⁺CK8⁺组细胞增殖受抑制程度高，差异均有统计学意义（均P<0.05）。DHT 1、10 nmol／L作用3 d后，AR CK5⁺CK8⁺组细胞较V CK5⁺CK8⁺组细胞迁移能力下降[迁移细胞数：（54±9）个比（113±21）个，（13±3）个比（34±6）个]，差异均有统计学意义（t＝4.450，P<0.01；t＝5.157，P<0.01）。DHT 1、10 nmol／L作用3周后，AR CK5⁺CK8⁺组细胞较V CK5⁺CK8⁺组细胞成瘤能力弱[克隆数：（39±　7）个比（105±16）个，（41±6）个比（86±6）个]，差异有统计学意义（t＝6.631，P<0.01；t＝8.662，P<0.01）。5 nmol／L LY＋10 nmol／L 5-AZA、5 nmol／L LY＋5 nmol／L γ-TT、10 nmol／L 5-AZA＋5 nmol／Lγ-TT、2.5 nmol／L LY＋5 nmol／L 5-AZA＋2.5 nmol／L γ-TT联合1 nmol／L DHT或10 nmol／L DHT作用2、4、6 d均能抑制CK5⁺CK8⁺细胞增殖（均P<0.05）。

结论

AR可以抑制从LNCaP中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞增殖，导致细胞迁移和成瘤能力下降；其可能通过抑制AKT-bcl-2信号通路的活化而发挥作用。

引用本文: 马志方, 曾胜, 郐海洋, 等. 雄激素受体对从前列腺癌LNCaP细胞分选出的CK5⁺CK8⁺细胞的作用及其调控机制 [J] . 肿瘤研究与临床, 2021, 33(1) : 42-47. DOI: 10.3760/cma.j.cn115355-20200306-00096.

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肿瘤的多成分组成以及数量的动态变化是肿瘤治疗过程需要考虑的问题，不同阶段肿瘤患者基因表达也会动态变化，根据基因检测结果选择靶向药物是晚期肿瘤患者个体化治疗的重要手段。肿瘤复杂组成的原因之一有干细胞学说，其认为肿瘤是由极少数干细胞和其分化产生的大量成熟细胞以及过渡细胞等多种细胞组成。干细胞学说是去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的进展机制之一，研究表明前列腺癌起源于前列腺癌干细胞，是由少量干细胞和大量不同分化程度的非干细胞组成的^[1,2,3]。干细胞和其他细胞标志物不同，生物学特点不同。不同分化程度的细胞雄激素受体（AR）和前列腺特异抗原（PSA）表达不同，对雄激素敏感程度不同。AR在前列腺癌的肿瘤细胞和基质细胞中表达不同，在干／祖细胞和非干／祖细胞中表达、作用也各不相同^[4,5,6,7]。本课题组在前期研究中成功地从多种人前列腺癌细胞株中分选出CK5⁺CK8⁺细胞，同时具有干细胞标志物CK5和成熟腺腔上皮标志物CK8的细胞，AR和PSA都有一定表达，并且从转移和侵袭能力强的PC3细胞中分选出的此类细胞多于LNCaP细胞。本研究将在从LNCaP细胞分选出的CK5⁺CK8⁺细胞的基础上，探讨AR对CK5⁺CK8⁺细胞的作用和调控机制。

1　材料与方法

1.1　主要材料

人前列腺癌细胞株LNCaP购自上海中国典型培养物保藏中心，RPMI 1640培养液、碘硝基四唑紫（INT）和琼脂糖均购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国Gibco公司。携带AR或空载体的慢病毒载体由美国罗彻斯特大学医学中心乔治韦伯肿瘤实验室惠赠。流式细胞仪为美国BD公司产品，荧光显微镜为日本Olympus公司产品。实验用多孔细胞培养板和Transwell系统购自美国Corning公司。兔抗人p-AKT多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，鼠抗人bcl-2单克隆抗体、兔抗人AR多克隆抗体（C-19）和鼠抗人GAPDH单克隆抗体（6c5）购自美国Santa Cruz公司。

1.2　CK5⁺CK8⁺细胞分选和携带AR病毒的感染

常规培养细胞，选择培养状态佳、接近融合的细胞进行细胞分选，分选步骤参见文献[8]。分选出的CK5⁺CK8⁺细胞数量开始较少，生长容易受污染，要特别注意无菌操作。将分选细胞培养于无血清、有生长因子的RPMI 1640条件培养液。待细胞数量达到感染要求时，使用携带AR或者空载体的慢病毒载体感染细胞，获得转入AR的AR CK5⁺CK8⁺细胞和转入空载体的V CK5⁺CK8⁺细胞，按说明书进行操作。为了模拟体内雄激素正常和去势的情况，各实验细胞均以1、10 nmol／L二氢睾酮（DHT）培养。

1.3　蛋白质印迹法检测CK5⁺CK8⁺细胞AR、p-AKT和bcl-2蛋白的表达

将培养的AR CK5⁺CK8⁺组及V CK5⁺CK8⁺组细胞加入适量RIPA裂解液，冰上放置30 min，转移至EP管，离心后将上清液转至新的EP管，配制凝胶，取25 μg蛋白，加适量缓冲液后上样，50 V电泳30 min后，100 V电泳2 h。打开转移盒，将海绵垫、滤纸、胶和聚偏氟乙烯（PVDF）膜等按照顺序叠放。将转移盒置入转移槽中，注满转移缓冲溶液。系统在4 ℃条件下100 V转印1 h。再将膜移至封闭液中封闭1 h，加入适量的一抗，室温摇动2 h。用PBET缓冲液清洗，加入适量二抗，室温摇动60 min，再用PBST缓冲液清洗，加入显影剂，在图像分析仪下采集图像。以GAPDH为内参照。

1.4　四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖

用1、10 nmol／L DHT作用V CK5⁺CK8⁺组及AR CK5⁺CK8⁺组细胞，或应用AKT信号通路活化抑制物LY 294002（简称LY）、γ-生育三烯酚（γ-TT）和（或）诱导AR表达的5-氮胞嘧啶（5-AZA）不同浓度的组合（5 nmol／L LY＋10 nmol／L 5-AZA、5 nmol／L LY＋γ-TT 5 nmol／L、10 nmol／L 5-AZA＋5 nmol／L γ-TT、2.5 nmol／L LY＋5 nmol／L 5-AZA＋2.5 nmol／L γ-TT，以未经上述药物作用的细胞为阴性对照组）联合1、10 nmol／L DHT作用于CK5⁺CK8⁺细胞，每种细胞设3个复孔。每孔以1×10⁵个细胞（1 000 μl）接种于12孔板，培养6 d，每孔在0、2、4、6 d分别加入5 mg／L MTT 100 μl，培养箱内继续作用4 h，加入二甲基亚砜（DMSO）400 μl。于570 nm处测吸光度（A）值。取3孔平均值表示细胞增殖水平，绘制细胞增殖曲线。

1.5　细胞迁移实验检测细胞迁移能力

消化AR CK5⁺CK8⁺组及V CK5⁺CK8⁺组细胞。以1×10⁶／ml重悬细胞，将100 μl细胞悬液加至Transwell上室。在Transwell下室加入500 μl含5 μg／ml纤维连接蛋白的RPMI 1640培养液。培养48 h，将上室取出，用棉签小心擦掉未穿过膜的细胞，用甲醇固定，滤膜3 min，苏木精染色2 min，用水仔细冲洗干净后于200倍显微镜下计数迁移细胞数。

1.6　软琼脂糖凝胶肿瘤克隆形成实验检测细胞成瘤能力

配制0.8%的琼脂糖凝胶并以每孔2 ml铺于6孔板。把AR CK5⁺CK8⁺组及V CK5⁺CK8⁺组细胞消化后重悬。将37 ℃的琼脂糖凝胶与3 ml细胞悬液（3 000个细胞）按照1∶1体积混合，待下层凝胶凝固，铺于6孔板上层，每孔加2 ml，重复3孔。上层胶凝固后每孔加入适量培养液，3 d更换1次。培养21 d后用1 mg／ml INT染色，培养过夜，计数直径>2 mm的克隆。

1.7　统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　CK5⁺CK8⁺细胞AR、p-AKT和bcl-2蛋白表达水平变化

1、10 nmol／L DHT作用后，与V CK5⁺CK8⁺组细胞比较，AR CK5⁺CK8⁺组细胞中AR蛋白表达均增强，p-AKT和bcl-2蛋白表达下降（图1），提示AKT-bcl-2信号通路活化受到抑制。

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图1

蛋白质印迹法检测AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞AR、p-AKT和bcl-2蛋白表达的影响

注：AR为雄激素受体；DHT为二氢睾酮；V组为通过慢病毒转入空载体的CK5⁺CK8⁺细胞；AR组为通过慢病毒转入AR基因的CK5⁺CK8⁺细胞；为了模拟体内雄激素正常和去势的情况，各实验细胞分别以1、10 nmol／L DHT培养

图1

蛋白质印迹法检测AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞AR、p-AKT和bcl-2蛋白表达的影响

2.2　AR对CK5⁺CK8⁺细胞增殖的影响

1、10 nmol／L DHT作用2～4 d后，与V CK5⁺CK8⁺组细胞比较，AR CK5⁺CK8⁺组细胞增殖受抑制程度更高，差异均有统计学意义（均P<0.05）（表1）。

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表1

四甲基偶氮唑盐法检测AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞增殖的影响（±s）

表1

四甲基偶氮唑盐法检测AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞增殖的影响（±s）

组别	样本数	1 nmol／L DHT				10 nmol／L DHT
组别	样本数	0 d	2 d	4 d	6 d	0 d	2 d	4 d	6 d
V CK5⁺CK8⁺组	3	0.325±0.004	0.688±0.017	1.225±0.037	1.623±0.083	0.326±0.004	0.685±0.002	1.547±0.066	2.231±0.050
AR CK5⁺CK8⁺组	3	0.323±0.007	0.564±0.007	0.840±0.051	1.050±0.070	0.325±0.028	0.556±0.046	0.880±0.094	1.010±0.083
t值		0.432	11.676	10.585	9.143	0.062	4.853	10.721	24.240
P值		>0.05	<0.05	<0.05	<0.05	>0.05	>0.05	<0.05	<0.05

注：以570 nm处吸光度值表示细胞增殖水平；AR为雄激素受体；DHT为二氢睾酮；为了模拟体内雄激素正常和去势的情况，各实验细胞分别以1、10 nmol／L DHT培养；AR CK5⁺CK8⁺组为通过慢病毒转入AR基因的CK5⁺CK8⁺细胞；V CK5⁺CK8⁺组为通过慢病毒转入空载体的CK5⁺CK8⁺细胞

2.3　AR对CK5⁺CK8⁺细胞迁移能力的影响

1、10 nmol／L DHT作用3 d后，与V CK5⁺CK8⁺组细胞比较，AR CK5⁺CK8⁺组细胞迁移数降低，差异有统计学意义（均P<0.01）（表2），提示转入AR基因可抑制CK5⁺CK8⁺细胞迁移能力。

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表2

细胞迁移实验检测AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞迁移能力的影响（个，±s）

表2

细胞迁移实验检测AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞迁移能力的影响（个，±s）

组别	样本数	1 nmol／L DHT	10 nmol／L DHT
V CK5⁺CK8⁺组	3	113±21	34±6
AR CK5⁺CK8⁺组	3	54±9	13±3
t值		4.450	5.157
P值		<0.01	<0.01

注：以200倍显微镜下迁移细胞数表示细胞迁移能力；AR为雄激素受体；DHT为二氢睾酮；V CK5⁺CK8⁺组为通过慢病毒转入空载体的CK5⁺CK8⁺细胞；AR CK5⁺CK8⁺组为通过慢病毒转入AR基因的CK5⁺CK8⁺细胞；为了模拟体内雄激素正常和去势的情况，各实验细胞分别以1、10 nmol／L DHT培养

2.4　AR对CK5⁺CK8⁺细胞成瘤能力的影响

AR CK5⁺CK8⁺细胞和V CK5⁺CK8⁺细胞用含1、10 nmol／L DHT的培养液培养3周，两种细胞均可克隆性生长，与V CK5⁺CK8⁺组细胞比较，AR CK5⁺CK8⁺组细胞形成克隆数降低，差异有统计学意义（均P<0.01）（表3），提示转入AR基因可以抑制CK5⁺CK8⁺细胞成瘤能力。

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表3

软琼脂糖凝胶肿瘤克隆形成实验观察AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞成瘤能力的影响（个，±s）

表3

软琼脂糖凝胶肿瘤克隆形成实验观察AR对从前列腺癌LNCaP细胞中分选出的CK5⁺CK8⁺细胞成瘤能力的影响（个，±s）

组别	样本数	1 nmol／L DHT	10 nmol／L DHT
V CK5⁺CK8⁺组	3	105±16	86±6
AR CK5⁺CK8⁺组	3	39±7	41±6
t值		6.631	8.662
P值		<0.01	<0.01

注：以>2 mm的克隆数表示细胞成瘤能力；AR为雄激素受体；DHT为二氢睾酮；V CK5⁺CK8⁺组为通过慢病毒转入空载体的CK5⁺CK8⁺细胞；AR CK5⁺CK8⁺组为通过慢病毒转入AR基因的CK5⁺CK8⁺细胞；为了模拟体内雄激素正常和去势的情况，各实验细胞分别以1、10 nmol／L DHT培养

2.5　LY、γ-TT和（或）5-AZA对CK5⁺CK8⁺细胞增殖的影响。

与阴性对照组比较，5 nmol／L LY＋10 nmol／L 5-AZA、5 nmol／L LY＋5 nmol／L γ-TT、10 nmol／L 5-AZA＋5 nmol／L γ-TT、2.5 nmol／L LY＋5 nmol／L 5-AZA＋2.5 nmol／L γ-TT联合1、10 nmol／L DHT作用2 d后细胞增殖抑制程度更高，差异均有统计学意义（均P<0.01），提示抑制AKT信号通路活化或者促进AR表达均可以抑制CK5⁺CK8⁺细胞增殖（表4）。

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表4

四甲基偶氮唑盐法检测AKT信号通路活化抑制剂LY 294002、γ-TT及诱导雄激素受体表达的5-AZA对从前列腺癌LNCap细胞中分选的CK5⁺CK8⁺细胞增殖的影响（±s）

表4

四甲基偶氮唑盐法检测AKT信号通路活化抑制剂LY 294002、γ-TT及诱导雄激素受体表达的5-AZA对从前列腺癌LNCap细胞中分选的CK5⁺CK8⁺细胞增殖的影响（±s）

组别	样本数	1 nmol／L DHT
组别	样本数	0 d	2 d	4 d	6 d
阴性对照组	3	0.116±0.001	0.285±0.018	0.394±0.013	0.457±0.016
5 nmol／L LY+ 10 nmol／L 5-AZA组	3	0.117±0.001	0.256±0.003	0.323±0.008	0.413±0.007
5 nmol／L LY+ 5 nmol／L γ-TT组	3	0.114±0.002	0.237±0.002	0.297±0.013	0.364±0.007
10 nmol／L 5-AZA + 5 nmol／L γ-TT组	3	0.116±0.002	0.223±0.007	0.279±0.023	0.321±0.014
2.5 nmol／L LY + 5 nmol／L 5-AZA +2.5 nmol／L γ-TT组	3	0.114±0.003	0.190±0.005	0.235±0.009	0.283±0.013
F值		0.562	27.093	50.178	58.584
P值		>0.05	<0.01	<0.01	<0.01

组别	样本数	10 nmol／L DHT
组别	样本数	0 d	2 d	4 d	6 d
阴性对照组	3	0.114±0.001	0.237±0.018	0.303±0.012	0.375±0.021
5 nmol／L LY+ 10 nmol／L 5-AZA组	3	0.111±0.002	0.202±0.004	0.263±0.107	0.314±0.007
5 nmol／L LY+ 5 nmol／L γ-TT组	3	0.114±0.002	0.183±0.003	0.233±0.006	0.282±0.010
10 nmol／L 5-AZA + 5 nmol／L γ-TT组	3	0.113±0.003	0.172±0.012	0.214±0.011	0.253±0.014
2.5 nmol／L LY + 5 nmol／L 5-AZA +2.5 nmol／L γ-TT组	3	0.109±0.007	0.135±0.005	0.176±0.009	0.192±0.013
F值		0.589	43.142	92.724	149.654
P值		>0.05	<0.01	<0.01	<0.01

注：以570 nm处吸光度值表示细胞增殖水平；DHT为二氢睾酮；γ-TT为γ-生育三烯酚；5-AZA为5-氮胞嘧啶；阴性对照组为未经LY 294002、 γ-TT和（或）5-AZA作用的细胞；组别中LY 294002简写为LY；为了模拟体内雄激素正常和去势的情况，各实验细胞分别以1、10 nmol／L DHT培养

3　讨论

内分泌治疗是晚期或者不适合手术的早期前列腺癌有效治疗手段，但绝大多数患者数年后会进展，对去势和抗雄激素药物治疗耐受，成为CRPC，从敏感到耐受的原因是目前前列腺癌研究的重点。本课题组前期研究发现，前列腺癌是由干／祖细胞（CD133⁺ CD44⁺AR^-PSA^-）、中间细胞（CK5⁺CK8⁺AR^±PSA⁺）和成熟腺腔上皮肿瘤细胞（CD133^-CD44^-CK5^-CK8／18⁺AR⁺ PSA⁺）等多种细胞成分组成的。干／祖细胞和中间细胞不表达或低表达AR，这部分细胞对雄激素不敏感，成熟腺腔上皮肿瘤细胞依赖雄激素，在现有内分泌治疗下，低浓度雄激素导致成熟腺腔肿瘤细胞减少，同时干／祖细胞和中间细胞因为可以耐受缺乏雄激素的环境，数量逐渐增加^[9,10]。低浓度雄激素压力下肿瘤不同成分细胞选择性生长是现有内分泌治疗失败、肿瘤进展为CRPC的可能原因之一。

目前大量研究支持雄激素-AR轴在前列腺癌的整个病程中都发挥重要作用这一观点。AR在不同成分的肿瘤细胞中表达及作用均不同。前期研究表明AR和PSA在CK5⁺CK8⁺中间细胞中有一定表达，但是AR对CK5⁺CK8⁺中间细胞的作用和调控机制仍不清楚。在人前列腺组织中，去势前后雄激素DHT的浓度分别为1 nmol／L和10 nmol／L，所以本研究的各项实验都是在这两种雄激素浓度培养下进行，这样可以更加科学地观察AR的作用。本研究发现将AR基因转入CK5⁺CK8⁺细胞可以抑制细胞增殖，降低细胞迁移和成瘤能力，这与AR对前列腺癌干／祖细胞的作用相似，与其对成熟腺腔上皮肿瘤细胞的作用相反。本课题组又对AR的作用机制进行了研究。影响细胞增殖的信号通路很多，其中AKT-bcl-2信号通路对前列腺癌细胞的增殖和侵袭转移有重要作用^[11]。本研究发现AR对CK5⁺CK8⁺细胞的抑制作用也是通过抑制细胞AKT-bcl-2信号通路活化来发挥作用的。干／祖细胞和中间细胞AR和PSA表达不同，AR均低表达，都对雄激素不敏感，可以在内分泌治疗压力下数量逐渐增多，并且干／祖细胞具有上皮-间质转化的特点，侵袭转移能力增强，这些可能都是肿瘤进展的原因。本课题组发现，在上述过程中AKT-bcl-2信号通路均发挥重要作用，靶向抑制这一信号通路活化可以同时抑制干／祖细胞和中间细胞增殖，同时抑制上皮-间质转化，这些结果为研发前列腺癌新的治疗药物提供了科学参考。

本课题组前期对前列腺癌患者内分泌治疗前后的肿瘤组织进行了CK5和CK8表达的免疫组织化学检测，初步结果发现CK8阳性率很高，治疗前后阳性率分别为（98.46±8.52）%、（95.37±7.68）%，差异无统计学意义；CK5阳性率治疗后有一定升高，治疗前后阳性率分别为（1.14±0.26）%、（9.23±4.51）%，差异无统计学意义^[8]。值得注意的是，虽然内分泌治疗前CK5⁺细胞极少，治疗后CK5⁺细胞数量增加，可以认为现有内分泌治疗确实可能导致CK5⁺CK8⁺中间细胞增加，但CK5阳性率也只有10 %左右，远低于预期，推测现有内分泌治疗会导致"对雄激素不敏感的CK5⁺CK8⁺中间细胞大量增加"的观点不成立，现有干细胞学说研究成果仍无法科学解释CRPC进展机制，雄激素-AR轴还有许多未知领域需进一步深入研究。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

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贡献者信息

马志方

山西医科大学第一医院泌尿外科，太原　030001

曾胜

南开大学附属第一中心医院泌尿外科，天津　300192

郐海洋

山西医科大学第一医院泌尿外科，太原　030001

杭天昆

山西医科大学第一医院泌尿外科，太原　030001

刘春

山西医科大学第一医院泌尿外科，太原　030001

通信作者

马志方

Email：zhifangma@163.com

关键词

前列腺肿瘤; CK5⁺CK8⁺细胞; 受体，雄激素;

基金项目

山西省自然科学基金面上项目（201601D011101）

山西省留学回国人员科技活动择优资助项目（（2017）397-10）

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2021-01-28

收稿日期：2020-03-06

本文编辑

周薇

本文责任校对

吕晶丽

Original Article

Role of androgen receptor in CK5⁺CK8⁺ cells isolated from prostate cancer LNCaP cells and its regulating mechanism

Ma Zhifang, Zeng Sheng, Kuai Haiyang, Hang Tiankun, Liu Chun

Published 2021-01-28

Cite as Cancer Res Clinic, 2021, 33(1): 42-47. DOI: 10.3760/cma.j.cn115355-20200306-00096

Abstract

Objective

To investigate the role of androgen receptor (AR) in CK5⁺CK8⁺ cells isolated from prostate cancer LNCaP cells and its regulating mechanism.

Methods

CK5⁺CK8⁺ cells were isolated from LNCaP cells by using flow cytometry. Lentivirus vector carrying AR gene was transferred in CK5⁺CK8⁺ cells. The experiments were divided into AR CK5⁺CK8⁺ group transfering AR and V CK5⁺CK8⁺ group transfering blank load. The expressions of AR, p-AKT and bcl-2 were tested by using Western blot assay under different concentrations of androgen (1 nmol/L and 10 nmol/L dihydrotestosterone). Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, cell migration assay and soft agarose gel clone formation assay was used to detect the effect of AR on the biological property of CK5⁺CK8⁺ cells. The effect of activated inhibitors such as LY 294002 (LY), γ-tocotrienol (γ-TT) and/or 5-fluorocytosine inducing AR expression (5-AZA) through AKT signal pathways on CK5 ⁺CK8⁺ cells proliferation was detected by using MTT assay.

Results

After AR gene was transferred into CK5⁺CK8⁺ cells, the expression of AR was increased, while the expression of p-AKT and bcl-2 was decreased. After the treatment of 1 nmol /L dihydrotestosterone and 10 nmol/L dihydrotestosterone for 2, 4 and 6 d, the cell proliferation inhibited degree of AR CK5⁺CK8⁺ cells was higher compared with that of V CK5⁺CK8⁺ cells, and the difference was statistically significant (all P < 0.05). After the treatment of 1 nmol/L dihydrotestosterone and 10 nmol /L dihydrotestosterone for 3 d, the migration ability of AR CK5 ⁺CK8⁺ cells was decreased compared with that of V CK5⁺CK8⁺ cells (the number of cell migration: 54±9 vs. 113±21, 13±3 vs. 34±6), and the differences were statistically significant (t=4.450, P<0.01;t=5.157, P<0.01).After the treatment of 1 nmol /L dihydrotestosterone and 10 nmol /L dihydrotestosterone for 3 weeks, the tumorigenic ability of AR CK5⁺CK8⁺ cells was reduced compared with that of V CK5⁺CK8⁺ cells (the number of clone: 39±7 vs. 105±16, 41±6 vs. 86±6), and the differences were statistically significant (t=6.631, P<0.01;t=8.662, P<0.01). And 5 nmol /L LY + 10 nmol/L 5-AZA, 5 nmol /L LY + 5 nmol/L γ-TT, 10 nmol/L 5-AZA + 5 nmol/L γ-TT, 2.5 nmol/L LY + 5 nmol/L 5-AZA + 2.5 nmol/L γ-TT combined with 1 nmol/L dihydrotestosterone or 10 nmol/L dihydrotestosterone after the treatment of 2, 4, 6 d inhibited the proliferation of CK5⁺CK8⁺ cells (all P < 0.05).

Conclusion

AR plays an inhibitory role in CK5⁺CK8⁺ cells isolated from prostate cancer cell line LNCaP and reduces the cell migration and tumorigenic ability through inhibiting activation of AKT-bcl-2 signal pathway.

Key words:

Prostatic neoplasms; CK5⁺CK8⁺ cells; Receptor, androgen

Contributor Information

Ma Zhifang

Department of Urology, First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Zeng Sheng

Department of Urology, the First Affiliated Central Hospital of Nankai University, Tianjin 300192, China

Kuai Haiyang

Department of Urology, First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Hang Tiankun

Department of Urology, First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Liu Chun

Department of Urology, First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

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