免疫检查点是肿瘤免疫治疗最为有效的研究靶点之一，以程序性死亡受体1及其配体1为主的免疫检查点抑制剂在多种肿瘤治疗中获得良好的响应率，但仍存在部分肿瘤应答率低的问题。近年来，双特异性抗体在肿瘤研究领域发展迅速，因其能靶向多个靶点，在肿瘤治疗中发挥联合作用，能够有效抑制肿瘤免疫逃逸。文章就靶向免疫检查点的双特异抗体研究进展和临床现状进行综述。
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免疫检查点抑制剂被认为是目前最为成功的免疫疗法，迄今为止已经有多种针对免疫检查点的药物上市。尽管如此，基于免疫检查点的免疫治疗在疗效与安全性等方面还有待提高。针对两个免疫检查点的单抗联合治疗可以提高治疗效果，但是会增加不良反应，双特异性抗体有潜力规避上述联合免疫治疗的相关限制[1]。文章主要从免疫检查点与免疫疗法之间的关系出发，针对免疫检查点的双特异性抗体药物在免疫治疗中的应用以及未来发展方向作一综述。
目前已经进行了大量的临床试验来评估单药和联合免疫检查点调节剂治疗的安全性和有效性，第一个进入市场的抗体是CTLA-4抑制剂ipilimumab，2010年Ⅲ期临床试验结果显示，与单独接受gp100疫苗（一种癌症疫苗，包括来自黑素体蛋白的HLA-A*0201限制性肽）的患者相比，使用ipilimumab显著延长了黑色素瘤患者的总生存（OS）期（10.1个月比6.4个月）[2]；随后基于一系列临床试验结果，ipilimumab于2011年被批准用于治疗黑色素瘤。2014年靶向程序性死亡受体1（PD-1）的抗体纳武利尤单抗（nivolumab）和pembrolizumab、2016年和2017年靶向程序性死亡受体配体1（PD-L1）的抗体atezolizumab、avelumab和durvalumab相继出现[3]。目前针对这些免疫检查点的单抗被用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、肾癌、结肠癌、卵巢癌等肿瘤。尤其在转移性黑色素瘤患者中，ipilimumab治疗的长期（超过3年）生存率约为20%[4]，PD-1抑制剂可达35%～50%[5,6]。
虽然免疫检查点治疗性单抗具有很好的疗效，但它们仅针对一部分患者，且在NSCLC、上皮癌、肝癌等实体瘤的应答率仅有10%～35%，除此之外通过免疫检查点的阻断增加免疫系统活性会引起炎症，即免疫相关的不良反应（irAE）。ipilimumab的irAE发生率约为75%（其中24%～43%为3级以上）[7]，PD-1/PD-L1抑制剂的irAE发生率为37%（其中10%～20%为3级以上）[8,9,10]。因此，应不断探索更安全有效的靶向免疫检查点抑制剂。
相对于单抗靶向治疗以及联合治疗，双特异性抗体可以降低药物耐受性和一些严重的不良反应，具有提高临床疗效和安全性的潜力，可作为新一代免疫治疗手段。
靶向免疫检查点单抗在很多肿瘤实例中都表现出显著的临床疗效，然而，这种阻断抗体的效能可能会因为与广泛表达于正常细胞上的免疫检查点配体结合而降低。这种肿瘤选择性的缺乏可能导致T细胞的普遍活化，且与自身irAE有密切的关联[11]。因此，利用双特异性抗体的特点，同时靶向肿瘤表面抗原及免疫检查点受体可能会成为一种可行的方式。
PD-1/PD-L1阻断抗体可以激活功能受到抑制的抗癌T细胞，对很多肿瘤（如晚期黑色素瘤和NSCLC等）均有显著的疗效。利用双特异性抗体同时靶向PD-L1和TAA，可使抗体更准确地定位到肿瘤细胞。靶向NDP-MSH-α和PD-L1的双特异性抗体通过双靶向的方式与肿瘤细胞结合，将抗体导向黑色素瘤细胞的同时，逆转肿瘤环境中的免疫抑制，其在B16-SIY黑色素瘤小鼠模型中显示出增强的特异性抗肿瘤效果，实现20%的肿瘤清除效率[12]。Koopmans等[13]构建了双特异性抗体PD-L1×CSPG4，其靶向PD-L1和在恶性黑色素瘤等其他各种难以治疗的肿瘤上选择性过表达的CSPG4，增强了对癌细胞的定向阻断能力，同时还可以显著增强抗癌T细胞的活化状态。对于转移性乳腺癌来说，靶向PD-L1和HER2的双特异性抗体BsPD-L1×rErbB2与单价抗PD-L1、HER2或联合抗PD-L1单抗和抗ErbB2单抗相比，成功降低了小鼠乳腺癌TUBO细胞的生长，并且与PD-L1、HER2抑制剂单独治疗相比，BsPD-L1×rErbB2的肿瘤清除率提高了5%[14]。
同时靶向PD-1和TAA的双特异性抗体不仅可阻断PD-1/PD-L1这条免疫检查点通路，还能连接T细胞与肿瘤细胞，激活微环境中的浸润性T细胞。Hou等[15]设计两种双特异性抗体形式，即DVD-Ig和IgG-scFv，分别靶向PD-1和c-MET，这些双特异性抗体在体外对表达c-MET的胃癌细胞系表现出有效的抗肿瘤活性，并在人胃癌异种移植的小鼠模型中介导了较强的肿瘤生长抑制作用。并且用该双特异性抗体处理的小鼠均呈现较为健康状态，说明该抗体仅有很少的不良反应[15]。Xiong等[16]设计的一种单链双特异性抗体BsDb，它不仅能有效抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中血管内皮生长因子165（VEGF165）刺激的增殖、迁移和成管，还能通过阻断PD-1/PD-L1，显著提高活化T细胞的增殖和干扰素γ（INF-γ）的产生，在HT29移植瘤小鼠中表现出了强大的抗肿瘤活性，肿瘤体积明显缩小。目前已经有针对性PD-1和VEGF的双特异性抗体正在等待Ⅰ期临床评估。
Li等[17]设计双特异性抗体（BsAb-5）可以同时靶向CD166+肿瘤干细胞（LCSC）中的c-MET和CTLA-4，具有很高的亲和力和特异性。该双特异性抗体可以抑制肝细胞生长因子（HGF）介导的肿瘤生长，包括增殖、迁移和凋亡，是一种抑制性的c-MET抗体。在体内，移植瘤分析显示BsAb-5组小鼠的肿瘤体积明显缩小，根据光通量指数分析可以看出CTLA-4单抗组有70%清除效果，而BsAb-5清除效果可达90%，表明该双特异性抗体具有用于治疗人类NSCLC的潜力[17]。
CD47是一种广泛表达的免疫检查点受体，在肿瘤细胞中经常上调。CD47与巨噬细胞和其他髓细胞上的受体SIRPα相互作用，抑制癌细胞吞噬并驱动免疫逃避。为了克服广泛表达CD47引起的耐受性问题，Dheilly等[18]设计了双靶向双特异性抗体，选择性地阻断表达特定肿瘤相关抗原（CD19或mesothelin）的恶性细胞上CD47-SIRPα的相互作用。这种全人源的天然IgG1分子可以将肿瘤靶向、CD47阻断和Fc介导的免疫激活机制联系到一起。该抗体对表达CD47生理水平的健康细胞只有微弱的作用，因此，该双特异性抗体可以有效而安全地靶向CD47，并且双特异性抗体在体内和体外都能有效地杀死癌细胞。
除了抑制性免疫检查点外，有研究人员发现，一些刺激性免疫检查点（如CD40、肿瘤坏死因子超家族等）需要某种形式的交联才能被激活，如双特异性分子ABBV-428被发现仅在结合了肿瘤抗原（间皮素）时才激活CD40，从而保证了肿瘤局部的免疫活化。因此单特异性CD40抗体引起的肝脏毒性和全身炎症反应在靶向肿瘤的双特异性CD40激动剂中没有被发现。4-1BB也是这种靶向肿瘤抗原的免疫治疗可用的激活性免疫检查点，Hinner等[19]设计了靶向4-1BB和HER2的双特异性分子PRS-343，其可以抑制肿瘤的生长。该抗体正在HER2+的乳腺癌患者中进行Ⅰ期临床评估（NCT03330561、NCT03650348）。
免疫检查点的阻断已被证实虽有一定的治疗效果，但只有一小部分患者对目前的免疫检查点阻断性治疗有反应[20]，其原因可能是因为肿瘤的免疫耐受。通过靶向同一细胞上的两个检查点分子，特别是通过多价化合物获得的协同效应，可以刺激免疫系统更有效地激活效应T细胞。并且，双免疫调节剂诱导的簇可以促进免疫突触的稳定，从而诱导更强的信号转导[3]，靶向肿瘤中表达均上调的两个免疫检查点也可以增强抗体的定位，避免或减少系统T细胞的整体激活。
靶向两个抑制性免疫检查点的双特异性抗体可以阻断两种抑制性通路，起到更好的联合治疗效果。同时靶向PD-1、PD-L1的一种双特异性抗体CTX-837，在体内可显著抑制肿瘤的生长，延长人类移植瘤小鼠的存活时间[21]。有研究团队开发了双特异性候选抗体，靶向PD-1和CTLA-4的XmAb20717、靶向CTLA-4和LAG3的XmAb22841以及靶向PD-1和ICOS的XmAb23104，它们优先结合到共表达目标受体的细胞上，通过选择性靶向肿瘤浸润性T细胞（TIL），实现更安全、更经济地联合检查点阻断[22]。另外，MGD013也是一种针对PD-1和LAG3的双免疫调节剂，PD-1和LAG3均表达于衰竭的T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞上，抑制这两个靶点可以刺激T细胞激活[23]，与单抗或联合单抗阻断相比，MGD013可以增强T细胞反应。
将免疫检查点抑制剂与激动剂相结合，可在控制调节性T细胞（Treg）抑制功能的同时，增强T细胞的扩增和效应功能，将"冷肿瘤"转化为"热肿瘤"[24,25]。双特异性抗体ATOR-1015可以同时靶向抑制性免疫检查点CTLA-4和刺激性免疫检查点OX40。从研究结果可以看出，ATOR-1015在体外诱导T细胞活化和Treg耗竭。在包括膀胱癌、结肠癌和胰腺癌在内的几种同基因肿瘤小鼠模型中，使用ATOR-1015治疗可降低肿瘤生长并提高小鼠存活率，并且治愈小鼠，具有长期免疫记忆效应。ATOR-1015的基于药物非临床研究质量管理规范（GLP）的安全性研究已经完成，已开展首次人体试验（NCT03782467）[26]。Muik等[27]设计的双特异性抗体mbsAb-PD-L1×4-1BB在小鼠体内产生了有效的抗肿瘤活性，而不引起肝毒性，并在体内和体外促进了人原代T细胞和TIL的增殖。目前相应的人源双特异性抗体DuoBody-PD-L1× 4-1BB（GEN1046）已经用于NSCLC、三阴性乳腺癌、子宫内膜癌等癌症患者，以评估其临床安全性（NCT03917381）。
抑制性免疫检查点与一些肿瘤发生、发展过程相关的细胞因子的联合也是研究者探索的方向之一。RANK（TNFRSF11a）和RANKL（TNFSF11）分别是肿瘤坏死因子受体和配体超家族成员，与CD40和CD40L同源。最近对进展期黑色素瘤和肺癌患者的回顾性临床研究表明，与单独治疗ICI相比，在ICI中添加抗RANKL抗体可提高整体应答率。因此Dougall等[28]尝试构建靶向RANKL和PD-1的双特异性抗体，结果显示，与抗RANKL＋PD-1相比，抗RANKL/PD-1双特异性抗体在多种皮下注射的肿瘤模型中取得了更好的抗肿瘤效果，与目前最有效的免疫治疗联合（抗PD-1联合抗CTLA-4抗体）相比，具有同等抗肿瘤效果。
转化生长因子β（TGF-β）也是一种多效的细胞因子，在肿瘤发展过程中发挥重要作用，M7824可以同时靶向PD-L1和TGF-β，它们的双重抑制可能增强抗肿瘤活性[29]。目前M7824已经进入临床阶段，针对小细胞肺癌、子宫颈癌、口咽癌等癌症的抗体药物已经进入了Ⅱ期临床试验，还有以一些针对乳腺癌、复发性头颈部鳞状细胞癌、卡波西肉瘤等的相关药物还在Ⅰ期临床试验阶段。应用M7824的针对实体瘤晚期患者的Ⅰ期临床试验显示，19例实体瘤患者对该药物均有反应，其中47%的患者可以达到部分缓解或完全缓解，但是患者都出现不同程度的免疫相关不良反应。在80例晚期NSCLC患者中进行的扩大试验结果显示，在所有患者中的客观缓解率为21.3%，体内PD-L1表达量高的患者疾病缓解情况较好，治疗相关的不良事件发生率为69%（55/80）[30]。M7824的早期疗效是令人鼓舞的，显示出了类似PD-1/PD-L1单抗治疗的效果，但出现了TGF-β相关的皮肤反应[31]，在重度预处理的晚期实体肿瘤患者中具有可管理的安全性。还有其他针对多种肿瘤的临床试验正在进行当中。
肿瘤微环境中的生物标志物有助于确定适用于特定治疗的患者群体，并为合理的治疗组合提供参考信息[32]。肿瘤细胞上的PD-L1表达可以确定哪些患者可以从PD-1或PD-L1阻断治疗中获益最大[33]，在肿瘤中也有更复杂的"基因标志"来识别哪些患者将表现出最佳的反应[34]。除此之外，目前大多数免疫治疗以TAA为靶标，它们通常在某种肿瘤类型中过表达，涵盖了更广泛的患者群体[35]。然而越来越多的基于TAA治疗的研究报道了这些治疗对正常组织有潜在的附带伤害。相比之下肿瘤特异性抗原（TSA）在肿瘤细胞中有选择性的表达，并且在不同个体中存在差异，为个性化的免疫治疗提供了机会[36]。双特异性抗体联合其他治疗方法也是一个发展方向，可以将双特异性抗体与嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）组合产生一种新的抗体形式，其可以产生长期的T细胞效应，同时诱导T细胞的瞬时活化，还可以通过同时刺激共刺激分子CD28来防止T细胞失活或抗原诱导的细胞死亡，最终发挥增强的抗肿瘤能力[37]。另外，由于T细胞靶向治疗会引起不良反应，特别是发生致命的细胞因子释放综合征（CRS），因而通过免疫疗法靶向NK细胞也是一种有吸引力的抗肿瘤策略。靶向NK细胞的双特异性杀伤细胞衔接子和三特异性杀伤细胞衔接子除了有强大的抗肿瘤性能外，还表现出比双特异性T细胞衔接子更低的毒性和更高的安全性，在实体瘤中将有更广阔的应用前景[38]。
所有作者均声明不存在利益冲突
