探讨谷胱甘肽硫转移酶M1（GSTM1）和谷胱甘肽硫转移酶M2（GSTM2）在甲状腺滤泡癌（FTC）中的表达及其临床意义。
收集基因表达综合（GEO）数据库中甲状腺滤泡性肿瘤基因芯片GSE82208数据，共52例样本，包括FTC 27例，甲状腺滤泡性腺瘤（FA）25例。提取基因矩阵数据并整理，利用R语言Limma包筛选出FTC和FA间差异表达基因。收集2000年1月至2020年12月辽宁省丹东市第一医院手术切除的FTC及FA标本各56例。采用免疫组织化学SABC法检测FTC和FA标本中GSTM1、GSTM2蛋白的表达水平，分析二者与FTC患者临床病理因素间的关系及二者间的相互关系。
基于GEO数据库数据，共获得40个FTC和FA间差异表达基因；其中FTC中表达上调9个，分别为GSTM1、GSTM2、COL6A2、CUX2、CLUH、TSC2、OGDHL、ACADVL、SDHA；表达下调31个。免疫组织化学法检测显示，在手术切除FTC标本中，GSTM1、GSTM2阳性率分别为71.4%（40/56）、80.4%（45/56），在FA中阳性率分别为23.2%（13/56）、14.3%（8/56），差异均有统计学意义（χ2值分别为26.11、49.03，均P<0.01）。FTC中GSTM1和GSTM2蛋白表达与临床分期、浸润程度及远处转移均有关（均P<0.05），与性别、年龄和肿瘤长径均无关（均P>0.05）。FTC中GSTM1和GSTM2表达呈正相关（r=0.384，P=0.004）。
FTC中GSTM1和GSTM2表达水平升高，二者可能相互作用，参与FTC的发生、发展。
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甲状腺滤泡性肿瘤是常见的甲状腺肿瘤类型，主要分为甲状腺滤泡性腺瘤（FA）及甲状腺滤泡癌（FTC）。大多数FTC和FA在形态上很难区分，两者最主要的区别是有无明确的包膜或血管侵犯。临床工作中有20% FTC被误认为FA[1]。谷胱甘肽硫转移酶（GST）能够催化还原性谷胱甘肽，参与肿瘤化疗药物的代谢[2]。本研究基于基因表达综合（GEO）数据库资料和手术切除标本，分析谷胱甘肽硫转移酶M1（GSTM1）和谷胱甘肽硫转移酶M2（GSTM2）在FTC中的表达，探讨二者与患者临床病理因素的关系，为FTC诊断及治疗提供新的思路。
从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载甲状腺滤泡性肿瘤基因芯片GSE82208数据，共52例样本，包括FTC 27例，FA 25例。将基因表达谱的原始数据利用Perl工具对ID和基因名转化，提取基因矩阵相关数据，将整理后的数据用R语言Limma包进行分析，按照以下条件筛选出FTC与FA之间差异表达的基因：（1）采用t检验，差异倍数校正后P<0.05；（2）log2差异倍数≥1，或log2差异倍数<-1。绘制差异基因火山图，根据差异基因在每个样本中的表达量绘制52例样本中差异基因表达热图。
收集2000年1月至2020年12月辽宁省丹东市第一医院手术切除FTC及FA标本各56例。FTC患者中，男性20例，女性36例，年龄（56±10）岁，范围22~76岁；所有FTC患者术前均未行放疗、化疗、内分泌及其他任何针对肿瘤的治疗，无甲状腺功能亢进、慢性淋巴细胞性甲状腺炎等甲状腺相关疾病。按照2017年美国癌症联合会（AJCC）分期标准进行临床分期。本研究经辽宁省丹东市第一医院医学伦理委员会批准（批准文号：202012069），所有患者均签署知情同意书。
一抗兔抗人GSTM1和GSTM2抗体及二抗均购自英国Abcam公司，即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。所有组织标本经10%甲醛溶液固定后，脱水、包埋，4 μm厚切片。微波修复，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，血清封闭；依次加入一抗（1∶200稀释）、二抗及SABC，DAB显色，苏木精对比染色，常规脱水，透明，中性树胶封片。以磷酸盐缓冲液（PBS）取代一抗作为阴性对照。
镜下GSTM1和GSTM2蛋白主要定位于细胞质或细胞膜，呈黄色或棕黄色颗粒。由两位经验丰富的病理科医生双盲法独立阅片。结果采用半定量计分法判断。阳性细胞比例评分：随机选取5个高倍（200倍）视野，每张切片中的阳性细胞比例<5%为0分，≥5%且<25%为1分，≥25%且<50%为2分，≥50%为3分；着色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色或棕黄色为2分，褐色或棕褐色为3分。两评分相乘≥4分为阳性，<4分为阴性。
采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料比较用χ2检验，条件不足者进行连续性修正。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用t检验。FTC组织中GSTM1和GSTM2蛋白表达的等级相关性采用Spearman法进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。
按照筛选条件，从GEO数据库中获得40个FTC和FA间差异表达的基因，其中表达上调9个，分别为GSTM1、GSTM2、COL6A2、CUX2、CLUH、TSC2、OGDHL、ACADVL、SDHA；表达下调31个（图1）。52例样本中40个差异表达基因热图见图2。
注：FTC为甲状腺滤泡癌；FA为甲状腺滤泡性腺癌；GEO为基因表达综合；红色为组织样本中基因的相对表达水平高，绿色为组织样本中基因的相对表达水平低；蓝色序号病例为FTC，黄色序号病例为FA
免疫组织化学检测显示，GSTM1和GSTM2蛋白在FA中不表达或局灶表达，二者在FTC中呈弥漫性强阳性表达（图3）。GSTM1、GSTM2在FTC中的阳性率分别为71.4%（40/56）、80.4%（45/56），在FA中的阳性率分别为23.2%（13/56）、14.3%（8/56），差异均有统计学意义（χ2值分别为26.11、49.03，均P<0.01）。
GSTM1和GSTM2蛋白在FTC中表达均与患者临床分期、浸润程度及是否远处转移有关（均P<0.05），与年龄、性别、肿瘤长径无关（均P>0.05）（表1）。
不同临床病理因素的甲状腺滤泡癌患者GSTM1和GSTM2蛋白表达状况比较[例（%）]
不同临床病理因素的甲状腺滤泡癌患者GSTM1和GSTM2蛋白表达状况比较[例（%）]
| 临床病理因素 | 例数 | GSTM1 | GSTM2 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | χ2值 | P值 | 阳性 | χ2值 | P值 | |||
| 性别 | ||||||||
| 男性 | 20 | 14（70.0） | 0.031 | 0.860 | 14（70.0） | 1.217 | 0.270 | |
| 女性 | 36 | 26（72.2） | 31（86.1） | |||||
| 年龄（岁） | ||||||||
| ≥ 55 | 16 | 10（62.5） | 0.370 | 0.543 | 10（62.5） | 3.080 | 0.079 | |
| <55 | 40 | 30（75.0） | 35（87.5） | |||||
| 肿瘤长径（cm） | ||||||||
| ≥ 4 | 34 | 27（79.4） | 2.703 | 0.100 | 28（82.4） | 0.015 | 0.902 | |
| <4 | 22 | 13（59.1） | 17（77.3） | |||||
| 临床分期 | ||||||||
| Ⅰ~Ⅱ期 | 30 | 18（60.0） | 4.135 | 0.042 | 21（70.0） | 4.391 | 0.036 | |
| Ⅲ~Ⅳ期 | 26 | 22（84.6） | 24（92.3） | |||||
| 浸润程度 | ||||||||
| 微小浸润 | 24 | 12（50.0） | 9.450 | 0.002 | 15（62.5） | 6.621 | 0.010 | |
| 广泛浸润 | 32 | 28（87.5） | 30（93.8） | |||||
| 远处转移 | ||||||||
| 有 | 18 | 16（88.9） | 3.963 | 0.047 | 11（61.1） | 4.558 | 0.033 | |
| 无 | 38 | 24（63.2） | 34（89.5） | |||||
注：GSTM1为谷胱甘肽硫转移酶M1；GSTM2为谷胱甘肽硫转移酶M2
Spearman分析显示，FTC中GSTM1和GSTM2蛋白表达呈正相关（r=0.384，P=0.004）（表2）。
甲状腺滤泡癌中GSTM1和GSTM2蛋白表达相关性（例）
甲状腺滤泡癌中GSTM1和GSTM2蛋白表达相关性（例）
| GSTM2 | GSTM1 | r值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴性 | |||
| 阳性 | 36 | 9 | 0.384 | 0.004 |
| 阴性 | 4 | 7 | ||
注：GSTM1为谷胱甘肽硫转移酶M1；GSTM2为谷胱甘肽硫转移酶M2
近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势。FTC是继甲状腺癌乳头状癌（PTC）的第二常见甲状腺恶性肿瘤，其侵袭性远高于PTC，以血运转移为主，淋巴转移少见[3]，根据浸润程度分为微小浸润FTC和广泛浸润FTC，两者预后差异明显[4]。FTC会通过血运转移至肺、骨及肝[5]，致使患者复发，生存期缩短，预后差[6,7]，因此积极探讨其发病机制具有重要意义。
随着高通量基因芯片技术的发展，生物信息学已成为探索生物学底层机制和研究人类复杂疾病诊断、治疗及预后的重要工具[8]。本研究从GEO数据库中下载52例（25例FA、27例FTC）人甲状腺滤泡性肿瘤基因表达谱数据，进行生物信息学分析后，共筛选出40个差异表达基因，包括上调基因9个，下调基因31个，上调基因中包括GSTM1和GSTM2。GST基因家族由多个基因型组成，与多种肿瘤发生存在关联。我们用免疫组织化学法检测GSTM1和GSTM2蛋白在FTC及FA组织中的表达情况，结果发现二者在FTC中表达均高于FA，与数据库分析结果一致。GSTM1基因位于1p13染色体，含有3种等位基因（a、b、null）。刘小涵等[9]对21篇文献进行Meta分析，发现GSTM1基因多态性与中国人群头颈部恶性肿瘤发病风险增加具有相关性。目前研究发现，肝癌、前列腺癌及乳腺癌均与GSTM1基因多态性相关[10,11,12]。本研究分析GSTM1和GSTM2蛋白与患者临床病理因素间关系时发现，在FTC中二者表达均与临床分期、浸润程度及远处转移有关，与年龄、性别、肿瘤大小均无关；FTC中GSTM1和GSTM2蛋白表达呈正相关。由此推测二者相互作用共同参与了FTC的发生与发展。既往研究发现畸胎瘤中过表达GSTM2与p38 MAPK的下调和AKT的激活有关[13]。而GSTM1和GSTM2在FTC中的促肿瘤作用及在信号通路中的具体机制尚待进一步研究。
综上所述，GSTM1和GSTM2可能共同作用参与了FTC的发生、发展，为FTC的靶向治疗及诊断提供了新的思路，同时为后期细胞水平和动物模型实验提供了依据。
所有作者均声明不存在利益冲突
