探讨卵巢癌组织中miRNA-4766-5p（miR-4766-5p）的表达及miR-4766-5p体外对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响及其相关机制。
选取2019年2月至2020年12月华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院行手术治疗的32例卵巢癌患者的癌组织及癌旁组织，选择卵巢癌细胞株（A2780、OC3、SKOV-3、HO-8910、OVCAR-3）及正常卵巢上皮细胞株IOSE80用于后续实验。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-4766-5p在卵巢癌组织和各细胞株中的相对表达量。以miR-4766-5p相对表达量最低的细胞株为实验对象，分别转染阴性对照质粒（对照组）和表达miR-4766-5p的质粒（miR-4766-5p组）。采用CCK-8法和Transwell实验分别检测过表达miR-4766-5p对所选细胞株细胞增殖和侵袭能力的影响。采用PITA和starBase V2.0软件预测miR-4766-5p的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因法进行验证。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测过表达miR-4766-5p对所选细胞株靶基因表达的影响。
卵巢癌组织和癌旁组织中miR-4766-5p相对表达量分别为1.06±0.17和5.25±0.70，差异有统计学意义（t=5.86，P<0.01）。与IOSE80细胞比较，各卵巢癌细胞株中miR-4766-5p相对表达量均降低（均P<0.01），其中OC3细胞中miR-4766-5p相对表达量最低，用于后续实验。CCK-8法检测显示，培养2、3、4 d后miR-4766-5p组OC3细胞吸光度值均低于对照组（均P<0.05）。Transwell实验显示，miR-4766-5p组和对照组OC3细胞的穿胶细胞数分别为（25±6）个和（86±11）个，差异有统计学意义（t=4.77，P<0.01）。采用PITA和starBase V2.0软件预测miR-4766-5p与微管去稳定蛋白1（STMN1）mRNA可能存在结合位点；双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-4766-5p的靶基因可能为STMN1。miR-4766-5p组和对照组OC3细胞中STMN1 mRNA相对表达量分别为0.28±0.05和1.00±0.05，差异有统计学意义（t=10.47，P<0.01）。与对照组相比，miR-4766-5p组OC3细胞STMN1蛋白表达降低，上皮细胞表型蛋白β-catenin表达升高，间质细胞表型蛋白Snail表达降低，细胞周期蛋白CDK2、cyclin E表达均降低。
miR-4766-5p在卵巢癌组织和卵巢癌细胞株中均低表达；miR-4766-5p可能通过下调其靶基因STMN1的表达，抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭。
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近年来卵巢癌发病率呈上升趋势[1]，是女性恶性肿瘤病死率最高的肿瘤[2]。微RNA（miRNA）是一类内源性表达的非编码单链RNA，长度约22个核苷酸[3]。miRNA在转录后水平调控人类1/3以上的基因表达，影响细胞多种生物学过程[4]。miRNA的表达变化在肿瘤发生、发展中扮演重要角色[5]。miRNA-4766-5p（miR-4766-5p）在胃癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤中可发挥抑癌效应[6,7]，但在卵巢癌中的表达情况和作用机制尚不明确。本研究分析卵巢癌组织和细胞株中miR-4766-5p的表达情况，探讨其体外对卵巢癌细胞增殖、侵袭能力的影响及可能的作用机制。
选择我院妇产科2019年2月至2020年12月行手术治疗的32例卵巢癌患者，均为浆液性癌，其中高分化8例、中分化15例、低分化9例。取卵巢癌组织及癌旁组织（距离肿瘤边缘>2 cm）标本，均于液氮中保存。本研究经我院伦理委员会批准（批准文号：2018伦研批31），患者均签署知情同意书。
卵巢癌细胞株A2780、OC3、SKOV-3、HO-8910、OVCAR-3及正常卵巢上皮细胞株IOSE80均购自美国标准培养物保藏中心（ATCC）；CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）相关试剂盒购自日本TaKaRa公司；阴性对照质粒、表达miR-4766-5p的质粒、双荧光素酶报告基因载体和PCR引物均购自上海吉玛生物制药有限公司；DMEM/F12培养液、RPMI 1640培养液、胎牛血清均购自美国Amresco公司；微管去稳定蛋白1（STMN1）、β-tubulin、β-catenin、Snail、CDK2、cyclin E相关一抗及二抗均购自美国CST公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。
在37 ℃、5% CO2培养箱中，OC3、OVCAR-3细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，A2780、SKOV-3、HO-8910细胞采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。在34 °C、5% CO2培养箱中，IOSE80细胞采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM/F12培养液培养。取miR-4766-5p相对表达量最低的对数生长期OC3细胞接种至6孔板，每孔2 ml细胞悬液，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行操作，将表达miR-4766-5p的质粒或阴性对照质粒转染至OC3细胞，分别为miR-4766-5p组和对照组。转染48 h后，收集细胞进行后续实验。
根据TRIzol试剂盒说明书提取卵巢癌组织或各细胞株中总RNA，经紫外分光光度仪检测浓度和纯度，取2 μg总RNA，反转录为cDNA。取2 μl cDNA进行qRT-PCR检测。检测miR-4766-5p相对表达量以U6作为内参照，检测STMN1 mRNA相对表达量以GAPDH作为内参照。qRT-PCR反应体系20 μl，反应条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性50 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。U6正向引物：5'-CT CGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3'；miR-4766-5p正向引物：5'-CAGA CATACTTTATCATCCCTT-3'，反向引物：5'-ACAATG CCACCTCCTCC-3'；STMN1正向引物：5'-TCAGCCCT CGGTCAAAAGAAT-3'，反向引物：5'-TTCTCGTGCTC TCGTTTCTCA-3'；GAPDH正向引物：5'-ACAACTTTG GTATCGTGGAAGG-3'，反向引物：5'-GCCATCACGC CACAGTTTC-3'。采用2-ΔΔCt法表示目的基因的相对表达量。
取对照组和miR-4766-5p组OC3细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，接种至96孔板，每孔4×103细胞，连续培养1~5 d。每孔加入10 μl CCK-8溶液，培养4 h，用酶标仪测定450 nm波长处吸光度（A）值，以A值为细胞增殖能力，绘制OC3细胞增殖曲线。
使用无血清培养液稀释Matrigel胶，向Transwell小室中加入60 μl Matrigel胶并凝固。取对照组和miR-4766-5p组OC3细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，加入200 μl（4×104）细胞悬液至Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。培养24 h后取出上室，用棉棒擦去未穿胶的细胞。采用甲醇溶液固定，0.1%结晶紫染色，100倍光学显微镜下计数穿胶细胞数并拍照。实验重复4次。
采用PITA和starBase V2.0软件预测与miR-4766-5p具有结合位点的靶基因。利用pGL3质粒构建含有预测靶基因片段的野生型载体和突变型载体。取对数生长期OC3细胞接种至6孔板，每孔2 ml细胞悬液，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书将构建的野生型载体或突变型载体分别与表达miR-4766-5p的质粒或阴性对照质粒转染入OC3细胞。细胞培养48 h后，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性。
取对数生长期各组OC3细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白。每组取20 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），半湿法转膜至聚偏氟乙烯膜，在5%脱脂牛奶中封闭。按一定比例稀释以下蛋白相关一抗：STMN1（1∶2 000）、β-tubulin（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、Snail（1∶500）、CDK2（1∶1 000）及cyclin E（1∶1 000），4 ℃反应。次日采用TBST溶液洗膜3次，稀释二抗（1∶5 000）并在室温下反应。TBST溶液洗膜3次，采用电化学发光（ECL）法检测底物，于凝胶成像系统中曝光、显影。以β-tubulin为内参照。
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
qRT-PCR检测结果显示，卵巢癌组织和癌旁组织中miR-4766-5p相对表达量分别为1.06±0.17和5.25±0.70，差异有统计学意义（t=5.86，P<0.01）。卵巢癌A2780、SKOV-3、OC3、HO-8910、OVCAR-3细胞及正常卵巢上皮IOSE80细胞中miR-4766-5p相对表达量分别为0.43±0.04、0.79±0.05、0.12±0.03、0.44±0.04、0.63±0.08和1.00±0.01，差异有统计学意义（F=23.74，P<0.01）；各卵巢癌细胞株中miR-4766-5p相对表达量与IOSE80细胞株中表达量差异均有统计学意义（t值分别为12.27、4.00、28.36、14.11、4.55，均P<0.01）。OC3细胞中miR-4766-5p相对表达量最低，选择OC3细胞进行后续实验。
转染miR-4766-5p质粒后，miR-4766-5p组和对照组OC3细胞中miR-4766-5p相对表达量分别为9.32±1.15和1.00±0.02，差异有统计学意义（t=7.23，P<0.01）。
取收集的转染成功的两组细胞培养，经CCK-8法检测显示，在培养2、3、4 d后，miR-4766-5p组OC3细胞A值均低于对照组（均P<0.05），提示过表达miR-4766-5p可抑制OC3细胞的增殖能力（图1）。
注：miRNA-4766-5p组为转染表达miRNA-4766-5p质粒的OC3细胞；对照组为转染阴性对照质粒的OC3细胞；两组样本数均为4；以吸光度值表示细胞增殖能力；与对照组比较，aP<0.05
Transwell实验结果显示，miR-4766-5p组穿胶OC3细胞数少于对照组（图2），分别为（25±6）个和（86±11）个，差异有统计学意义（t=4.77，P<0.01），提示过表达miR-4766-5p可抑制OC3细胞的侵袭能力。
注：miRNA-4766-5p组为转染表达miRNA-4766-5p质粒的OC3细胞；对照组为转染阴性对照质粒的OC3细胞
经PITA和starBase V2.0软件预测，miR-4766-5p可能与STMN1 mRNA互补结合（图3）。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，STMN1野生型质粒（pGL3-WT-STMN1）+ miR-4766-5p阴性对照质粒组、pGL3-WT-STMN1+表达miR-4766-5p质粒组OC3细胞相对荧光素酶活性差异有统计学意义（1.00±0.04比0.26±0.08，t=8.53，P<0.01）；STMN1突变型质粒（pGL3-MT-STMN1）+ miR-4766-5p阴性对照质粒组、pGL3-MT-STMN1+表达miR-4766-5p质粒组OC3细胞相对荧光素酶活性差异无统计学意义（1.03±0.10比0.95±0.09，t=0.55，P>0.05）。提示miR-4766-5p的靶基因可能为STMN1。
注：STMN1为微管去稳定蛋白1
qRT-PCR检测结果显示，miR-4766-5p组和对照组OC3细胞中STMN1 mRNA相对表达量分别为0.28±0.05和1.00±0.05，差异有统计学意义（t=10.47，P<0.01）。提示过表达miR-4766-5p可下调OC3细胞STMN1 mRNA的表达。
蛋白质印迹法检测结果显示，与对照组相比，miR-4766-5p组OC3细胞STMN1蛋白表达降低，上皮细胞表型蛋白β-catenin表达升高，间质细胞表型蛋白Snail表达降低，细胞周期蛋白CDK2、cyclin E表达均降低（图4）。
注：STMN1为微管去稳定蛋白1；miRNA-4766-5p组为转染表达miRNA-4766-5p质粒的OC3细胞；对照组为转染阴性对照质粒的OC3细胞
卵巢癌具有快速扩散和浸润性生长的特点，miRNA在卵巢癌的形成过程中发挥至关重要的作用[8]。多种miRNA（如miR-378a-3p、miR-222-3p、miR-29c-3p、miR-34a-5p、miR-1224-5p）被证实在卵巢癌组织中表达异常，发挥明显促癌或抑癌作用[9,10,11,12,13]。有研究表明，miR-4766-5p过表达可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，miR-4766-5p可发挥抑癌效应[14]。miR-4766-5p在卵巢癌中的表达和作用机制鲜见报道。
本研究结果显示，miR-4766-5p在卵巢癌组织中的表达低于癌旁组织，在各卵巢癌细胞株中的表达水平低于正常卵巢上皮细胞，提示miR-4766-5p可能参与卵巢癌的发生、发展。本研究进一步发现，上调miR-4766-5p的表达后，卵巢癌OC3细胞的增殖和侵袭能力均降低，提示miR-4766-5p在卵巢癌细胞中发挥抑癌效应。miRNA是一类高度进化保守的非编码RNA，其通过与靶基因mRNA的3'UTR互补结合，抑制靶基因的表达[15,16]。在本研究中，我们通过PITA和starBase V2.0软件预测显示，miR-4766-5p可与STMN1 mRNA互补结合。STMN1蛋白是一种微管解聚蛋白，通过调控纺锤体的形成，影响细胞周期的进展[17]。近年来，STMN1蛋白在肿瘤发病机制中的研究成为热点，研究显示其发挥致癌基因的作用[18]。Zhang等[19]报道STMN1蛋白在肝癌组织中高表达，与肝癌患者血管侵犯、较高的组织学分级、较高的临床分级和较短的生存时间密切相关，沉默STMN1表达可以调节细胞增殖、迁移、耐药性等。研究显示STMN1蛋白在卵巢癌细胞株中上调，沉默STMN1基因可抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为[16]。本研究结果显示，转染表达miR-4766-5p的质粒可明显下调卵巢癌OC3细胞中STMN1的表达。上皮间质转化是指细胞上皮细胞表型重新编程为间充质表型，这是卵巢癌细胞发生侵袭的重要分子机制。本研究结果显示，miR-4766-5p过表达的OC3细胞STMN1基因表达受抑制，上皮细胞表型蛋白β-catenin表达上调，间质细胞表型蛋白Snail表达下调，提示OC3细胞的上皮间质转化过程被抑制，细胞侵袭能力降低；细胞周期调控蛋白CDK2和cyclin E表达降低，提示OC3细胞增殖能力降低。
综上所述，miR-4766-5p在卵巢癌组织和细胞株中均低表达，miR-4766-5p可能通过下调STMN1基因的表达而抑制卵巢癌OC3细胞的恶性生物学行为。本研究为以miR-4766-5p为靶点的miRNA途径的卵巢癌基因治疗提供了一定的理论基础和实验依据。
所有作者均声明不存在利益冲突
