探讨野黄芩素通过miRNA-496（miR-496）、基质细胞衍生因子1（SDF-1）对子宫颈癌细胞株HCC94细胞增殖及迁移能力的影响。
取对数生长期的HCC94细胞，分别加入20 μmol/L野黄芩素溶液（野黄芩素组）和二甲基亚砜（DMSO）（对照组）。分别采用CCK-8法和Transwell实验检测两组HCC94细胞增殖和迁移能力，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-496和SDF-1 mRNA的相对表达量。采用生物信息学软件TarBase预测miR-496的靶基因，并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。采用蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达情况。
与对照组比较，培养第3、4、5天，野黄芩素组HCC94细胞增殖能力均降低（均P<0.05）。野黄芩素组和对照组HCC94细胞的穿胶细胞数分别为（25±5）个和（134±19）个，野黄芩素组细胞迁移能力较对照组降低（t=5.61，P<0.01）。对照组和野黄芩素组miR-496相对表达量分别为1.07±0.12和11.24±2.75，差异有统计学意义（t=3.68，P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验结果证实SDF-1是miR-496的下游靶基因。野黄芩素组和对照组HCC94细胞中SDF-1 mRNA相对表达量分别为0.29±0.05和1.01±0.07，差异有统计学意义（t=7.22，P<0.01）。与对照组比较，野黄芩素促进miR-496表达后，SDF-1蛋白、细胞增殖蛋白细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）、细胞迁移蛋白Slug和Zeb-2表达均降低。
野黄芩素可通过miR-496-SDF-1轴抑制子宫颈癌HCC94细胞的增殖及迁移。
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子宫颈癌是全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一，对女性生命健康构成严重威胁[1]。近年来由于子宫颈癌诊断方法及治疗策略的改进，患者预后得到很大改善[2]。然而晚期子宫颈癌的治疗效果并不理想，临床迫切需要新的治疗手段。野黄芩素是一种已被鉴定的中药活性单体成分，分离自灯盏细辛、木蝴蝶等中药[3]。野黄芩素可抑制炎症反应、抑制肿瘤生长、改善神经损伤[4]；能够抑制结肠癌细胞活力并诱导其凋亡，发挥显著的抗肿瘤效应[5]。野黄芩素对子宫颈癌细胞的作用尚不明确。本研究探讨野黄芩素对子宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响及其可能机制，为探究子宫颈癌治疗新方法提供依据。
子宫颈癌细胞株HCC94购自美国标准培养物保藏中心；野黄芩素（纯度≥98%）购自上海益宏生物化工有限公司；DMEM/F12培养液、胎牛血清购自美国Amresco公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶试剂盒购自美国Promega公司；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司；基质细胞衍生因子1（SDF-1）mRNA野生型载体、SDF-1 mRNA突变型载体、对照模拟物、miR-496模拟物购自上海吉玛生物制药有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。SDF-1、β-微管蛋白（β-Tubulin）、细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）、Slug、Zeb-2一抗和二抗均购自美国CST公司。
子宫颈癌HCC94细胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期HCC94细胞接种至24孔板，对照组加入DMSO溶液，野黄芩素组加入野黄芩素溶液（以DMSO溶解野黄芩素至20 μmol/L），进行后续实验。
取两组HCC94细胞，按照细胞密度1×104/ml接种至96孔板，培养5 d，弃去培养液，再加入含10% CCK-8溶液的培养液培养3 h，使用全自动酶标仪检测450 nm波长处的吸光度（A）值，绘制细胞生长曲线。
取两组HCC94细胞，按照细胞密度1×105/ml接种至Transwell小室上室，下室中加入含10%胎牛血清的培养液。培养箱中培养24 h，3%多聚甲醛溶液固定25 min，0.3%结晶紫溶液染色25 min，在100倍倒置显微镜下观察细胞，统计穿胶细胞数。
采用TRIzol试剂提取HCC94细胞总RNA，合成互补DNA，采用qRT-PCR试剂盒扩增检测。反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性13 s，63 ℃退火35 s，71 ℃延伸35 s，共40个循环。以U6为内参照，分析miR-496相对表达量；以GAPDH为内参照，分析SDF-1 mRNA相对表达量。miR-496正向引物：5'-CGCTGA GTATTACATGGCCAATCTC-3'，反向引物：5'-ATACC ACTGCTGTTGGGTCTG-3'；GAPDH正向引物：5'-AC AACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物：5'-GCCA TCACGCCACAGTTTC-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3'；SDF-1 mRNA正向引物：5'-ATTCTCAA CACTCCAAACTGTGC-3'，反向引物：5'-ACTTTAGCT TCGGGTCAATGC-3'。以2-ΔΔCt表示miR-496和SDF-1 mRNA相对表达量。
采用生物信息学软件TarBase预测miR-496的靶基因，结果显示miR-496可能与SDF-1 mRNA的3'-UTR存在结合位点（图1）。取对数生长期的HCC94细胞，依据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，分别将SDF-1 mRNA野生型载体、SDF-1 mRNA突变型载体与对照模拟物或miR-496模拟物共转染至HCC94细胞，培养48 h后，采用双荧光素酶试剂盒检测每组HCC94细胞的相对荧光素酶活性。
注：SDF-1为基质细胞衍生因子1
取两组HCC94细胞，加入细胞裂解液制备蛋白样本，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，分离完成后转印至聚偏氟乙烯膜，在TBST溶液制备的脱脂牛奶中封闭。按1∶1 000稀释一抗SDF-1、β-Tubulin、CDK3、Slug、Zeb-2，将一抗与聚偏氟乙烯膜在4 ℃下培养10 h，与1∶5 000稀释的二抗培养3 h，加入化学发光液，在凝胶成像系统中显像。
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以
±s表示，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
CCK-8法检测结果显示，培养第3、4、5天，与对照组比较，野黄芩素组HCC94细胞增殖能力均降低（均P<0.05），表明野黄芩素可抑制HCC94细胞的增殖能力（表1、图2）。
注：对照组加入二甲基亚砜溶液；野黄芩素组加入野黄芩素溶液（以二甲基亚砜溶解野黄芩素至20 μmol/L）；与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01
CCK-8法检测野黄芩素对子宫颈癌HCC94细胞增殖能力的影响（
±s）
CCK-8法检测野黄芩素对子宫颈癌HCC94细胞增殖能力的影响（±s）
| 组别 | 样本数 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 3 | 0.26±0.01 | 0.48±0.04 | 0.85±0.07 | 1.58±0.09 | 1.65±0.06 |
| 野黄芩素组 | 3 | 0.27±0.02 | 0.38±0.05 | 0.60±0.06 | 1.10±0.07 | 1.14±0.08 |
| t值 | 0.17 | 2.53 | 3.47 | 6.74 | 7.47 | |
| P值 | 0.874 | 0.064 | 0.026 | 0.003 | 0.002 |
注：对照组加入二甲基亚砜溶液；野黄芩素组加入野黄芩素溶液（以二甲基亚砜溶解野黄芩素至20 μmol/L）；以450 nm波长处的吸光度值表示细胞增殖能力
Transwell实验结果显示，野黄芩素组和对照组HCC94细胞的穿胶细胞数分别为（25±5）个和（134±19）个，差异有统计学意义（t=5.61，P<0.01），提示野黄芩素可抑制HCC94细胞的迁移（图3）。
注：对照组加入二甲基亚砜溶液；野黄芩素组加入野黄芩素溶液（以二甲基亚砜溶解野黄芩素至20 μmol/L）
qRT-PCR检测结果显示，对照组和野黄芩素组HCC94细胞中miR-496相对表达量分别为1.07±0.12和11.24±2.75，差异有统计学意义（t=3.68，P<0.01），提示野黄芩素可促进HCC94细胞中miR-496表达。
双荧光素酶报告基因实验结果显示，对照模拟物+SDF-1 mRNA野生型共转染组与miR-496模拟物+SDF-1 mRNA野生型共转染组相对荧光素酶活性分别为1.02±0.11和0.29±0.07，miR-496模拟物+SDF-1 mRNA野生型共转染组的相对荧光素酶活性下降（t=5.53，P<0.01）；对照模拟物+SDF-1 mRNA突变型共转染组与miR-496模拟物+SDF-1 mRNA突变型共转染组相对荧光素酶活性分别为0.96±0.10和0.93±0.26，差异无统计学意义（t=0.22，P>0.05）；提示miR-496可靶向结合SDF-1 mRNA。
qRT-PCR检测结果显示，野黄芩素组和对照组HCC94细胞中SDF-1 mRNA相对表达量分别为0.29±0.05和1.01±0.07，差异有统计学意义（t=7.22，P<0.01），提示野黄芩素促进miR-496表达后可抑制SDF-1 mRNA的表达。
蛋白质印迹法检测结果显示，野黄芩素促进miR-496表达后，SDF-1蛋白、细胞增殖蛋白CDK3、细胞迁移蛋白Slug和Zeb-2表达均降低（图4）。
注：对照组加入二甲基亚砜溶液；野黄芩素组加入野黄芩素溶液（以二甲基亚砜溶解野黄芩素至20 μmol/L）；SDF-1为基质细胞衍生因子1；CDK3为细胞周期蛋白依赖激酶3；β-Tubulin为β-微管蛋白
研究表明野黄芩素对肝癌、结肠癌、胃癌等多种癌症的发展起着显著的调控作用[6]。Shi等[7]研究发现，野黄芩素治疗后，纤维肉瘤细胞增殖率下降、细胞凋亡率升高，纤维肉瘤细胞的迁移和侵袭能力被抑制。本研究结果发现，野黄芩素处理子宫颈癌HCC94细胞后，HCC94细胞的增殖和迁移能力均被抑制。miRNA是一类内源性非编码RNA，通过在转录水平互补配对结合靶基因mRNA，抑制靶基因表达[2,8]。既往研究表明，miR-200b、miR-320c、miR-329-3p等在子宫颈癌组织或细胞株中表达异常，参与调控子宫颈癌细胞周期、凋亡、自噬、侵袭等活动，与子宫颈癌患者的生存期相关[9,10,11]。miR-496在非小细胞肺癌、前列腺癌、鼻咽癌等肿瘤细胞中发挥抑癌作用，可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，加快肿瘤细胞的凋亡[12,13,14]。本研究结果显示，野黄芩素处理子宫颈癌HCC94细胞后，miR-496在细胞中的相对表达水平升高，野黄芩素可能通过调节miR-496表达发挥效应。
本研究通过生物信息学软件TarBase预测显示，miR-496与SDF-1 mRNA的3'-UTR存在结合位点。SDF-1基因位于人染色体10q11.21，SDF-1蛋白属于趋化因子蛋白家族，在胚胎发育、炎症反应、肿瘤发生等过程中发挥重要调控作用[15,16]。许多肿瘤被发现存在SDF-1蛋白的过表达，与肿瘤患者的不良预后相关[17,18]。SDF-1蛋白在子宫颈癌组织中表达水平高于癌旁组织，与子宫颈癌长径和国际妇产科联盟（FIGO）组织学分级相关，下调SDF-1蛋白表达能够抑制子宫颈癌细胞的增殖和迁移，增强子宫颈癌细胞对放疗的敏感性[19,20]。本研究结果显示，野黄芩素促进子宫颈癌HCC94细胞中miR-496表达后，SDF-1基因表达被明显抑制。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，miR-496能够作用于SDF-1 mRNA的3'-UTR。HCC94细胞中SDF-1基因表达降低后，细胞增殖蛋白CDK3、细胞迁移蛋白Slug和Zeb-2表达均降低，表明HCC94细胞的增殖和迁移能力受到抑制。
总之，中药活性单体成分野黄芩素可以抑制子宫颈癌细胞的增殖和迁移能力，其作用机制可能是野黄芩素诱导激活子宫颈癌细胞中miR-496的表达，进而抑制SDF-1基因表达。野黄芩素可能对子宫颈癌具有潜在的治疗作用。
所有作者均声明无利益冲突
