探讨免疫细胞化学P16/Ki-67双染、P16INK4α单染及高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）检测对高级别子宫颈病变的筛查价值。
回顾性分析2019年3月至2021年7月于太原钢铁（集团）有限公司总医院同时行子宫颈薄层液基细胞学（TCT）及HR-HPV检测的622例患者临床资料，对患者剩余细胞学标本进行P16/Ki-67双染和P16INK4α单染检测。其中334例TCT结果提示为意义不明的非典型鳞状细胞（ASCUS）以上病变及HPV阳性患者行阴道镜病理活组织检查。以病理结果为参照，比较P16/Ki-67双染、P16INK4α单染及HR-HPV检测筛查高级别鳞状上皮内瘤变（HSIL）及子宫颈癌的阳性预测值、灵敏度、特异度及准确度。
以组织病理学结果为参照，结合TCT检测结果，622例患者中31例为HSIL，其中P16/Ki-67双染阳性22例（71.0%），P16INK4α单染阳性23例（74.2%），HR-HPV检测阳性25例（80.6%）；4例为子宫颈癌，3种检测方法阳性率均为100.0%（4/4）。622例患者中，P16/Ki-67双染、P16INK4α单染及HR-HPV检测筛查出HSIL及子宫颈癌的阳性率分别为13.99%（87/622）、25.40%（158/622）、21.38%（133/622）；阳性预测值分别为29.89%、17.09%、21.08%；准确度分别为91.19%、78.94%、83.28%；特异度分别为89.77%、77.98%、82.46%；灵敏度分别为74.29%、77.14%、82.86%。P16/Ki-67双染的阳性率、阳性预测值、特异度、准确度均高于P16INK4α单染及HR-HPV检测，差异均有统计学意义（z值分别为-5.062和-3.418、2.328和2.450、5.436和3.570、6.043和4.161，均P<0.05）；HR-HPV检测的灵敏度高于P16/Ki-67双染及P16INK4α单染，但差异均无统计学意义（z值分别为-0.890、1.017，均P>0.05）。
HR-HPV检测更适用于初次子宫颈病变筛查；P16/Ki-67双染可作为一种潜在的细胞联合筛查工具或有效的患者分流工具；P16INK4α单染具有一定的局限性。
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随着细胞学检测筛查子宫颈癌的开展，许多国家在降低子宫颈癌发病率和死亡率方面取得显著成效[1]。子宫颈癌初步筛查的目标是检测子宫颈癌前病变。现阶段，细胞学及高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）检测是较常见的检测方法，但细胞学检测灵敏度低，HPV检测特异度低，且阴道镜转诊率较高[2]。因此，寻找更特异、更准确的检测方法成为子宫颈癌筛查的研究热点。近年来，包括P16/Ki-67双染和P16INK4α单染的子宫颈细胞免疫细胞化学染色作为一种新型子宫颈癌筛查手段被推广[3,4,5]。但鲜有研究分析比较P16/Ki-67双染、P16INK4α单染及HR-HPV检测对子宫颈病变筛查的准确性。本研究比较这3种检测方法在高级别鳞状上皮内瘤变（HSIL）及子宫颈癌筛查中的价值。
回顾性分析2019年3月至2021年7月在太原钢铁（集团）有限公司总医院行HR-HPV检测及液基薄层细胞学（TCT）检测的622例患者临床资料，对患者剩余细胞学标本进一步行P16/Ki-67双染和P16INK4α单染检测。其中334例TCT结果提示为意义不明的非典型鳞状细胞（ASCUS）以上病变及HPV阳性患者行阴道镜病理活组织检查。所有患者病理结果由病理科主任医师复核。本研究经太原钢铁（集团）有限公司总医院医学伦理委员会批准（批准文号：[2021]伦审字（K202119）号），豁免患者知情同意。
使用一次性取样毛刷插入子宫颈管，顺时针方向旋转5圈后取出折断，将沾有子宫颈分泌物的毛刷置于特制的保存液，用二代杂交捕获技术（HC2）检测HR-HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型）DNA。Rlu/Co≥1.0时诊断为HR-HPV阳性，反之为阴性。
使用美国罗氏诊断公司CINtec PLUS细胞学试剂盒，将收集的细胞用TCT制备薄片一张，使用美国罗氏诊断公司全自动免疫组织化学染色机进行染色，参照试剂盒说明书设置染色程序。判读标准：P16信号与Ki-67信号在同1个细胞内同时出现胞质棕染和胞核红染，判断为阳性；仅P16或Ki-67单独显色或均不显色，判断为阴性。所有的载玻片均由2名有经验的病理医师进行盲检。
采用多聚螯合物酶法进行免疫细胞化学染色。鼠抗人P16蛋白单克隆抗体及PathCIN p16INK4α试剂盒由深圳森盈生物科技有限公司提供。操作步骤按试剂盒说明书进行。结果判读标准：P16INK4α阳性表达定位于细胞核及细胞质内，呈棕色或棕黄色染色，1张细胞片中观察到≥1个P16INK4α着色的细胞即判读为阳性。
采用SPSS 23.0统计软件分析数据，计数资料以频数（%）表示，3种检测方法灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阳性率的比较采用比率z检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
以组织病理学结果为参照，结合TCT检测结果，622例患者中539例为正常或慢性炎性反应，其中P16/Ki-67双染阳性41例（7.6%），P16INK4α单染阳性98例（18.2%），HR-HPV检测阳性68例（12.6%）；48例为低级别鳞状上皮内瘤变（LSIL），其中P16/Ki-67双染阳性20例（41.7%），P16INK4α单染阳性34例（70.8%），HR-HPV检测阳性36例（75.0%）；31例为HSIL，其中P16/Ki-67双染阳性22例（71.0%），P16INK4α单染阳性23例（74.2%），HR-HPV检测阳性25例（80.6%）；4例为子宫颈癌，3种检测方法阳性率均为100.0%（4/4）。以上结果显示，随着子宫颈病变级别的升高，P16/Ki-67双染、P16INK4α单染及HR-HPV检测的阳性率均升高。
622例患者中，P16/Ki-67双染、P16INK4α单染及HR-HPV检测筛查出HSIL及子宫颈癌的阳性率分别为13.99%（87/622）、25.40%（158/622）、21.38%（133/622）；阳性预测值分别为29.89%（95% CI 28.40%~31.38%）、17.09%（95% CI 16.24%~17.94%）、21.08%（95% CI 20.03%~22.13%）；准确度分别为91.19%（95% CI 85.68%~94.70%）、78.94%（95% CI 74.99%~82.89%）、83.28%（95% CI 79.14%~87.44%）；特异度分别为89.77%（95% CI 85.28%~93.63%）、77.98%（95% CI 74.08%~81.88%）、82.46%（95% CI 78.34%~86.59%）；灵敏度分别为74.29%（95% CI 66.86%~78.00%）、77.14%（95% CI 73.29%~81.00%）、82.86%（95% CI 78.71%~87.00%）。P16/Ki-67双染的阳性率、阳性预测值、特异度、准确度均高于P16INK4α单染及HR-HPV检测，差异均有统计学意义（z值分别为-5.062和-3.418、2.328和2.450、5.436和3.570、6.043和4.161，均P<0.05）；HR-HPV检测的灵敏度高于P16/Ki-67双染及P16INK4α单染，但差异无统计学意义（z值分别为-0.890、1.017，均P>0.05）。
目前应用较广的子宫颈癌筛查方法主要是TCT联合HR-HPV检测，但HR-HPV检测的特异性有限，我们的研究结果也证实了这一观点。生物标志物P16INK4α蛋白作为一种细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂，被证实存在于HPV感染的子宫颈细胞中，且HPV E7蛋白能够靶向P16-Rb通路，导致P16过度表达[6]。与TCT检测相比，P16和HR-HPV检测特异度更好，可作为识别子宫颈癌前期病变的一种工具[7]，P16甚至可以用于管理ASCUS或LSIL患者及分诊HPV阳性患者[8]。本研究结果显示，P16INK4α单染阳性率随着子宫颈病变级别的升高而呈上升趋势，P16INK4α单染筛查HSIL及子宫颈癌的灵敏度和特异度均低于HR-HPV检测。而我国学者研究显示，在非子宫颈上皮内瘤变（CIN）病变中P16阳性率低于HPV阳性率，在CIN++的病变中P16阳性率与HPV相近，表明P16提示病变的作用比HPV检测更强[8]。
国内外研究结果提示，P16可发现能转化为癌细胞的异常细胞，在一定程度上提示子宫颈病变[8,9,10]。但P16在细胞学标本中有较强的非特异性着色，有研究显示在未经处理的液基细胞标本中，其阳性率可达80%以上，而且P16的过表达可在正常化生细胞或萎缩细胞及发育不良的细胞中观察到，它甚至可在子宫内膜细胞及子宫颈正常柱状细胞中染色。另外，P16染色结果常需要结合细胞形态进行判读，而且免疫细胞化学染色本身有假阳性或假阴性结果的存在，这增加了阅片医师的工作量，导致其临床应用效果不好。
Ki-67是一种在分裂细胞中表达的核蛋白，用作细胞增殖标志；P16是通过抑制S期参与细胞周期调节的肿瘤抑制因子，能够抑制细胞增殖。因此，在子宫颈细胞内同时检测到Ki-67和P16的过表达，提示细胞HPV感染并有发展为子宫颈癌的可能。已有多项国内外研究评估了P16/Ki-67双染在ASCUS/LSIL分流及巴氏细胞学阴性、HPV阳性患者分流中的临床效果[11,12,13,14,15]。本研究显示，P16/Ki-67双染阳性率随着子宫颈病变级别的升高而升高，而且HSIL组的P16/Ki-67阳性率高于LSIL组和正常及慢性炎性反应组。国内外研究报道，P16/Ki-67双染与HPV检测相比有相似或轻度降低的灵敏度，而特异度明显升高[11,12,13]。我们的结果也显示，与P16INK4α单染及HR-HPV检测相比，P16/Ki-67双染筛查HSIL及子宫颈癌具有较高的特异度和准确度，灵敏度则略低，提示它能作为一种有效的筛查方法应用于临床。我们的研究结果显示，通过P16/Ki-67双染可以降低阴道镜转诊率，与Ordi等[14]和Areán-Cuns等[15]的研究结果相似；而且对于ASCUS或LSIL患者，采用相同的细胞样本进行检测，患者不必再去医院进行专科检查，减轻了医疗资源的压力。另外，P16/Ki-67双染不需要对阳性细胞进行辅助形态学诊断，评估标准以至少1个细胞显示P16、Ki-67共存为阳性，这与P16单染相比大大简化了结果判读过程，有效减轻了阅片医师的负担，并能保证结果的客观性和可重复性，也能够更好地区分真阳性和假阳性结果。
综上，本研究显示3种检测方法对筛查HSIL及子宫颈癌的灵敏度差异无统计学意义，而P16/Ki-67显示了比P16INK4α单染和HR-HPV检测更高的特异度、准确度和阳性预测值。因此，P16/Ki-67双染可作为一种潜在的细胞联合筛查工具或有效的患者分流工具，能够无创且相对明确、客观地帮助医生和患者判断是否需要做进一步检查，从而降低阴道镜转诊率，避免过度医疗，同时帮助临床医生对患者进行精准分层管理，为临床诊疗提供了依据。
所有作者均声明不存在利益冲突
