甲状腺癌发病率持续升高，其中以分化型甲状腺癌为主要类型。分子生物学的发展研究有助于推动甲状腺癌患者的早诊早治和精准治疗，同时也为预后不佳的特定类型如放射性碘难治性分化型甲状腺癌患者提供了潜在的治疗方向。文章总结了分化型甲状腺癌的重点高频基因变异及其作用机制、分子生物学检测在临床诊断方面的应用，以及特定基因变异与临床病理学特征及预后的相关性等。
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甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，2003年至2015年我国甲状腺癌发病增长率达21.1%[1]。监测、流行病学和最终结果（SEER）数据库统计2010年至2016年美国甲状腺癌5年生存率为98.3%，同期我国甲状腺癌5年生存率为84.3%[2]。分子生物学发展有助于推动甲状腺癌早诊早治和精准治疗，同时也为预后不佳特定类型如进展性放射性碘难治性（RAIR）分化型甲状腺癌（DTC）患者带来曙光。文章就DTC分子生物学研究进展及其在诊断和预后判断方面的应用进行综述。
DTC分子生物学改变包括基因突变、染色体重排、拷贝数异常、异常甲基化等，主要涉及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路。基因点突变和染色体重排是最常见最重要的甲状腺肿瘤发生机制，前者代表鼠类肉瘤病毒癌基因同源体B1（BRAF）和鼠肉瘤病毒（RAS）基因突变，而后者典型是转染重排原癌基因/甲状腺乳头状癌融合基因（RET/PTC）和配对盒基因8/过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PAX8/PPARγ）染色体重排。
BRAF突变是甲状腺癌最常见的基因突变，PTC中检出率为40%~70%[3]。BRAF突变中最常见T1799A转换突变，罕见变异亦有T599I错义突变、K601E错义突变、T599dup插入突变等。T1799A突变导致该点位缬氨酸转换为谷氨酸（又称V600E突变），该转换可能通过插入一负电荷残基模拟活化片段磷酸化，干扰磷酸化结合环与活化环的相互作用，导致最终表达的BRAF激酶转化为具有催化活性构象，引发下游级联反应。
RAS突变发生率仅次于BRAF突变，其编码细胞膜内表面的高度同源G蛋白，其固有GTP酶可将有活性GTP-RAS水解为无活性GDP-RAS；RAS突变可能通过增强其与GTP的亲和力或抑制GTP酶的自我水解作用，导致编码蛋白处于持续激活构象[4]。RAS突变可通过PI3K、MAPK和Wnt-β-catenin等通路影响细胞生长、增殖和分化。RAS突变多见于滤泡状肿瘤，其在甲状腺癌各亚类中的发生率为：滤泡状腺瘤（FA）20%~40%，滤泡状甲状腺癌（FTC）30%~50%，乳头状甲状腺癌10%~20%，低分化型甲状腺癌（PDTC）20%~50%及未分化甲状腺癌（ATC）10%~60%[4]。
TERT和RNA组分两个核心亚基，前者构成催化亚基，后者作为端粒延长模板。最常见的两种TERT启动子（TERTp）突变1 295 228C>T（C228T）和1 295 250C>T（C250T），两者互斥发生，C228T突变更为常见。两种突变均可诱发端粒酶异常激活，导致细胞永生化和恶性转化。TERTp突变见于10%~15% PTC、15%~20% FTC、35%~45% PDTC和40%~75% ATC[5]。TERTp突变在高细胞亚型PTC（TCPTC）中检出率显著高于经典亚型PTC（CPTC）和滤泡亚型PTC（FVPTC）。目前尚未在正常甲状腺组织、良性病变或甲状腺髓样癌（MTC）中发现TERT启动子突变。
RET原癌基因位于10号染色体长臂（10q11.2），编码细胞膜酪氨酸受体激酶。发生重排时，RET基因3'端与配对基因5'端融合，配对基因提供磷酸化结构域，引发MAPK或PI3K通路异常激活。RET/PTC重排在散发性PTC中检出率为10%~40%，而在有射线暴露史（包括偶然暴露和治疗性暴露）的PTC患者中检出率达50%~85%[6]。最常见的重排类型是RET/PTC1和RET/PTC3，RET/PTC1在散发性PTC中占60%~70%，而射线诱导性PTC尤其切尔诺贝利核泄漏事件后10年内的PTC患者中RET/PTC3则占据主导地位。61例切尔诺贝利事件后10年内白俄罗斯儿童PTC患者甲状腺标本中，38例（38/61，62.3%）检出RET/PTC重排，其中24例（24/38，63.2%）RET/PTC3阳性[7]。
PAX8/PPARγ基因重排由2、3号染色体易位t（2；3）（q13；p25）所致。PAX8基因编码配对盒基因家族转录因子，在甲状腺分化发育和组织特异性基因表达中具有重要作用。PPARγ编码核受体PPAR亚家族成员，参与调节多种靶基因转录。基因重排导致嵌合体PAX8-PPARγ融合蛋白（PPFP）过度表达，而体外试验已证实PPFP通过加速细胞周期转变、抑制细胞凋亡和消除细胞锚定依赖性生长等机制参与肿瘤发生。PAX8/PPARγ基因重排最常见于FTC，发生率5%~30%[8]。
NTRK隶属于跨膜酪氨酸激酶，在神经元分化发育中发挥重要作用。染色体倒置、缺失或易位等均可导致NTRK基因融合，造成配体非依赖性Trk激酶组成性激活。甲状腺癌中NTRK融合基因包括EML4-NTRK3、ETV6-NTRK3、IRF2BP2-NTRK1、TPR-NTRK1、TPM3-NTRK1、TFG-NTRK1等[9]。斯隆-凯特琳纪念癌症中心（MSKCC）报道NTRK融合基因检出率为2.28%（13/571）[10]。相较于成年人散发性甲状腺癌，NTRK融合基因相对多见于儿童PTC和切尔诺贝利事件后遭受大剂量辐射暴露PTC患者，检出率分别为2%~26%[10]和3%~15%[11]。
在甲状腺肿瘤发生相关基因异常中，体细胞基因突变最为常见。除上述高发突变外，TP53、CTNNB1、IDH1等基因突变亦值得关注。TP53突变常导致抑癌蛋白失活或表达缺失，PDTC、ATC中检出率为15%~30%、60%~80%[16]。CTNNB1（catenin-β1）突变通过抑制蛋白降解使更多β-catenin蛋白进入细胞核内上调促癌基因表达。IDH1突变导致代谢酶活性位点和催化活性改变，影响细胞增殖分化相关信号通路。
尽管超声引导下细针穿刺活组织检查（FNAB）细胞学诊断仍是甲状腺结节良恶性鉴别的金标准，但细胞学不确定病例的存在为诊断提出严峻挑战，因此有必要将分子生物学检测纳入甲状腺结节的规范评估流程。"纳入"类检测的代表是"7基因突变检测组"，可检测BRAF V600E、N/H/K-RAS基因突变及RET/PTC-1/3、PAX8/PPARγ基因重排。Bellevicine等[17]纳入207例细胞学不确定结节患者，Bethesda Ⅲ~Ⅴ级结节恶性率分别为26%、35%、93%，该条件下检测特异度分别为64%、90%、100%，阳性预测值（PPV）分别为42%、80%、100%。"排除"类检测的代表是"基因表达分类器（GEC）"，确证试验纳入265例细胞学不确定结节，在Bethesda Ⅲ~Ⅴ级结节中检测灵敏度分别为90%、90%、94%。该技术升级版"基因测序分类器（GSC）"，确证试验纳入213例细胞学不确定结节FNAB标本，Bethesda Ⅲ~Ⅴ级结节恶性率为25%、22%、57%，该条件下检测灵敏度分别为93%、88%、100%，特异度为71%、64%、50%，阴性预测值（NPV）分别为97%、95%、100%[18]。对比发现GSC特异度（94.3%比61.4%，P<0.001）和PPV（60.0%比33.3%，P=0.01）均显著高于GEC，提示GSC具备作为综合类检测方法的潜力；此外GSC在Hurthle细胞为主的结节中良性检出率显著高于GEC（88.8%比25.7%，P<0.01），扩展了该方法在这类结节中的应用[19]。综合性检测方法目前的最佳代表是ThyroSeq二代测序（NGS），ThyroSeq v3确证试验纳入257例Bethesda Ⅲ~Ⅳ级结节FNAB标本，样本恶性率30%条件下ThyroSeq v3检测灵敏度93%，特异度为81%，NPV为97%，PPV为68%[20]。另有两种基于miRNA表达的检测方法ThyGenX/Thyra-MIR和RosettaGX Reveal，前者将基因突变和miRNA表达检测结合，样本恶性率32%时检测灵敏度为89%，特异度为85%，NPV为94%[21]；后者样本恶性率为32%时检测灵敏度为85%，特异度为72%，NPV为91%[22]。
将组织病理学与分子生物学检测结合无疑提高了甲状腺结节诊断评估的准确性，但缺乏多中心、大样本量试验、缺乏同组样本中不同方法检测效用对比等问题在一定程度上阻碍了对上述检测方法的准确评估和大规模临床应用。
甲状腺癌管理的主要目标是预防复发、降低死亡率同时减少治疗相关不良反应，而在治疗获益与风险之间取得平衡的关键在于对患者个体精准的危险分层。
Xing等[23]提出BRAF V600E突变型（后称"BRAF+"）PTC较野生型（后称"BRAF-"）在腺体外侵犯、淋巴结转移方面比值比（OR）分别为4.0、5.0（P<0.001），提示BRAF V600E突变与侵袭性生物学行为相关。肿瘤复发率BRAF+为20.9%（213/1 017），BRAF-为11.6%（125/1 082），校正后风险比（HR）为1.38（P<0.001），表明BRAF+对PTC复发有独立预测价值[24]。肿瘤相关死亡率BRAF+为5.3%（45/845），BRAF-为1.1%（11/1 004），校正年龄、性别后HR为2.66（P<0.001），表明该突变与PTC肿瘤相关死亡率升高相关；校正腺体外侵犯、淋巴结转移、远处转移等因素后，HR为1.21（95% CI 0.53~2.76），肿瘤相关死亡率仍在突变组偏高，但差异无统计学意义[25]。
Park等[26]纳入TERT启动子突变型（后称"TERTp+"）DTC 43例、野生型（后称"TERTp-"）350例，两组年龄、腺体外侵犯、远处转移方面的差异均有统计学意义。Póvoa等[27]得出肿瘤相关死亡率TERTp+为31.3%（5/16），TERTp-为1.5%（3/202），校正后HR为10.1（P=0.01）。Ebina等[28]前瞻性随访685例PTC术后患者，TERTp+组较TERTp-组10年病因特异性生存率（CSS）（73.7比98.1%，P<0.001）和10年无病生存（DFS）率（53.7%比93.3%，P<0.001）均显著降低。综上表明TERTp突变与DTC高侵袭性、高复发率、高病死率相关。
有研究将507例PTC分为BRAF-/TERTp-、BRAF+/TERTp-、BRAF-/TERTp+和BRAF+/TERTp+ 4组，双阳性组较双阴性组在分期Ⅲ~Ⅳ期、腺体外侵犯、淋巴结转移、远处转移复发等方面差异均有统计学意义（P<0.001）；肿瘤复发率依次为8.7%（25/287）、16.3%（26/159）、19.2%（5/26）、68.6%（24/35），双阳性组较其余3组HR依次为8.51（P=0.005）、3.62（P<0.001）、6.16（P<0.001），提示两种突变共存PTC复发率显著升高[29]。Liu等[30]纳入164例PTC复发患者，4组中RAIR-PTC占比分别为30.2%（16/53）、70.3%（45/64）、55.6%（5/9）、97.4%（37/38），双阳性组较双阴性组OR为81.04（P<0.001）。以上提示BRAF+/TERTp+对不良预后具有很大影响。
RAS突变与FTC、FVPTC不良预后具有一定相关性，但RAS突变在良性腺瘤中的高检出率限制了其在诊断和预后判断方面的应用。Song等[31]将551例DTC分为RAS-/TERTp-（240例）、RAS+/TERTp-（47例）、RAS-/TERTp+（7例）和RAS+/TERTp+（6例）等4组，双阳性组较双阴性组在肿瘤复发、肿瘤相关死亡率方面差异有统计学意义，提示RAS突变与TERTp突变共存与DTC不良预后显著相关。其他常见于PDTC、ATC的基因突变如TP53、EIF1A、β-catenin突变等，其组织学分布特征提示上述突变可能在肿瘤侵袭进展中具有重要作用，出现于DTC时可能提示预后不良，但因检出率低而难以付诸临床应用。
分子生物学高危DTC，即具备BRAF+/TERTp+、RAS+/TERTp+、TP53、EIF1A或β-catenin突变等，推荐行甲状腺全切除术（TT）、预防性颈部淋巴结清扫（PND）和放射性碘（RAI）治疗[32]。已有侵袭性生物学行为者，分子生物学高危则预示治疗失败率高、复发率高，建议初始治疗时尽可能早期完整消除癌灶并长期密切随访。
Huang等[33]纳入955例SI-PTC和406例孤立性侵袭性PTC（Siv-PTC）患者，复发率BRAF+为8.1%（26/321），BRAF-为2.2%（14/634）（校正后HR为4.01，P<0.001），在肿瘤长径1~4 cm、2~4 cm、3~4 cm等亚组中复发率差异均有统计学意义，校正后HR为3.10、5.58、14.73；肿瘤长径2~4 cm、3~4 cm亚组BRAF V600E突变SI-PTC与Siv-PTC复发率差异均无统计学意义；提示BRAF+突变与SI-PTC高复发率显著相关。因此肿瘤长径>1 cm BRAF+ SI-PTC推荐行TT+PND±RAI；BRAF- SI-PTC复发率、死亡率低，推荐腺叶切除术（LT）。Ebina等[28]前瞻性随访309例SI-PTC患者，倾向性评分匹配得出TERTp-组LT（217例）与TT（59例）术后患者10年CSS（均为100%）和DFS（96.6%比96.9%）差异无统计学意义；TERTp+组LT（28例）与TT（5例）术后患者10年CSS（均为100%）差异无统计学意义，但10年DFS（64.5%比100%）差异有统计学意义。综上，TERTp+ SI-PTC建议行TT+PND±RAI，TERTp- SI-PTC则建议行LT。
Ito等[34]纳入340例PTMC患者，随访5年肿瘤增大（即肿瘤长径较初诊增加≥3 mm）者占比6.4%，新发淋巴结转移者占比1.4%，随访10年上述比例分别为15.9%、3.4%；性别、年龄、初诊肿瘤长径等因素均与肿瘤增大或淋巴结转移无明显相关性；109例随访期间手术，术后平均随访76个月未见复发病例；以上提示临床低危PTMC可考虑长期随访观察。Huang等[33]研究表明BRAF+和BRAF- SI-PTC术后复发率在肿瘤长径≤1 cm亚组差异无统计学意义（P=0.24）。Zhou等[35]纳入943例PTC分析得出肿瘤直径≤ 5 mm时BRAF+与中央区淋巴结转移显著相关（P=0.009）。综上，BRAF- PTMC建议长期随访观察，BRAF+临床低危PTMC建议早期行LT+PND，分子生物学高危PTMC则建议早期积极治疗如TT+PND±RAI。
BRAF V600E突变、TERTp突变均可导致甲状腺碘代谢相关基因表达受损、缺失，腺体对放射性碘亲和力下降。Luo等[36]纳入13项研究、1 431例DTC（含603例RAIR-DTC）患者，分析得出腺体外侵犯（OR=2.28，P<0.01）、BRAF+（OR=3.60，P<0.01）、TERTp+（OR=9.84，P<0.01）、组织学类型高度恶性（OR=1.94，P=0.01）等因素可显著增加RAIR-DTC发生率。因此BRAF+和（或）TERTp+者，推荐在TT基础上行PND以尽可能避免RAIR-DTC发生，但多数患者甲状腺摄碘能力并非完全丧失，因此术后仍推荐RAI治疗。
FNAB细胞学诊断是甲状腺结节良恶性鉴别的金标准，但对于细胞学不确定病例则有必要将分子生物学检测纳入评估流程，目前综合效能最佳的检测方法为ThyroSeq v3。BRAF、RAS、TERTp突变等均与DTC高复发率、高死亡率、侵袭性生物学行为等不良预后因素相关，BRAF+/TERTp+ PTC具有极强侵袭性和极差的临床预后。
所有作者均声明不存在利益冲突
