探讨结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF V600E基因突变与临床病理特征的相关性。
选取山西省肿瘤医院2020年1月至2021年12月手术切除并经病理证实为结直肠癌217例患者标本，回顾性分析患者临床资料。采用直接测序法检测手术切除组织的石蜡标本中KRAS、NRAS、BRAF V600E基因突变情况。比较不同临床病理特征患者的KRAS、NRAS、BRAF V600E突变率。
217例结直肠癌患者中KRAS、NRAS、BRAF V600E基因突变率分别为48.4%（105/217）、4.1%（9/217）、3.7%（8/217），其中1例（0.5%）患者同时存在KRAS和NRAS突变。NRAS基因突变与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、血管瘤栓/神经侵犯均无相关性（均P>0.05）；年龄≥60岁患者KRAS基因突变率高于<60岁患者[55.3%（63/114）比40.8%（42/103），χ2=4.55，P=0.033]，KRAS基因突变与其他临床病理特征均无相关性（均P>0.05）；伴远处转移的患者BRAF V600E基因突变率高于无远处转移患者[16.7%（4/24）比2.1%（4/193），P=0.006]，BRAF V600E基因突变与其他临床病理特征均无相关性（均P>0.05）。
结直肠癌患者年龄大可能易发生KRAS基因突变，伴远处转移者BRAF V600E基因突变率较高，NRAS基因突变与临床病理特征无相关性。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，据2018年全球癌症统计数据显示，结直肠癌的发病率和死亡率分别居全球第3位和第2位，已经成为严重威胁人类健康的疾病之一[1]。结直肠癌的发生、发展是一个多基因、多步骤调控的复杂过程，研究发现MAPK信号通路的异常激活在结直肠癌发生、发展过程中起着重要作用[2]，位于MAPK信号转导通路上的RAS、BRAF基因已经成为结直肠癌靶向治疗的重要分子标志物[3]，美国国立综合癌症网络（NCCN）指南推荐所有结直肠癌患者均应行KRAS、NRAS、BRAF基因检测[4]。目前RAS、BRAF V600E基因状态与结直肠癌临床病理特征之间的关系尚存在争议。本研究通过分析结直肠癌组织中KRAS、NRAS及BRAF V600E基因突变情况，探讨其与结直肠癌临床病理特征的关系，以期为结直肠癌患者制定个体化治疗方案提供参考。
纳入标准：（1）经术后病理检查确诊结直肠癌；（2）术前未行任何治疗；（3）临床病理资料完整。排除标准：（1）合并炎症性肠病或其他部位原发恶性肿瘤；（2）临床病理资料缺失。回顾性收集山西省肿瘤医院2020年1月至2021年12月经手术切除并经病理检查证实的217例结直肠癌患者资料，对其手术切除标本行KRAS、NRAS及BRAF V600E基因检测。患者年龄（60±12）岁，范围22~88岁；193例单纯行结直肠癌根治术，15例行结直肠癌根治术及同期肝转移灶切除术，6例在结直肠癌局部根治术后6个月内行肝转移灶切除术，3例在结直肠癌局部根治术后6个月内行肺转移灶胸腔镜切除术。本研究经我院医学伦理委员会批准（批准文号：201763），所有患者、家属均签署知情同意书。
所有病理标本均经10%甲醛溶液固定12~24 h，石蜡包埋。将石蜡包埋的肿瘤组织8 μm厚切片，取4~8张放入EP管中用于DNA提取。严格按照FFPE样品DNA分离试剂盒（德国Qiagen公司）说明书，经过脱蜡、裂解、消化、修复、吸附、洗脱等步骤，提取基因组DNA，用核酸蛋白测定仪测定DNA纯度和浓度，调整DNA浓度2~3 ng/μl，-20 ℃保存备用。
人类KRAS、NRAS、BRAF基因突变联合检测试剂盒购自北京鑫诺美迪基因公司。按照说明书，以提取的基因组DNA为模板，采用聚合酶链反应（PCR）方法进行基因扩增。取5 μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线分析仪观察电泳结果。取PCR纯化产物0.5 μl，加入NaAc、乙醇，离心半径9.5 cm、13 500 r/min 4 ℃离心30 min，待乙醇挥发后加入Hi-Di，溶解DNA，应用PCR仪（新加坡ThermoFisher Scientific公司）进行变性翻译，于96孔板点样，使用ABI-3130xl基因测序仪（日本ABI公司）测序，检测包括KRAS、NRAS基因第2、3、4号外显子及BRAF基因的V600E位点的体细胞突变情况。
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以
±s表示；计数资料以频数（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
217例结直肠癌患者中，男性125例（57.6%），女性92例（42.4%）；年龄<60岁103例（47.5%），≥60岁114例（52.5%）；右半结肠癌42例（19.4%），左半结肠癌43例（19.8%），直肠癌132例（60.8%）；肿瘤长径（4.7±1.7）cm，范围1~12 cm，肿瘤长径<4.5 cm者120例（55.3%），≥4.5 cm者97例（44.7%）；腺癌202例（93.1%），黏液腺癌15例（6.9%）；分化程度：中高分化161例（74.2%），低分化56例（25.8%）；T1~2期48例（22.2%），T3期60例（27.6%），T4期109例（50.2%）；淋巴结未转移109例（50.2%），淋巴结转移108例（49.8%）；未远处转移193例（88.9%），远处转移24例（11.1%）；无血管瘤栓/神经侵犯160例（73.7%），血管瘤栓/神经侵犯57例（26.3%）；TNM分期：Ⅰ~Ⅱ期101例（46.5%），Ⅲ~Ⅳ期116例（53.5%）。
217例手术切除标本均进行了KRAS、NRAS、BRAF V600E基因检测。（1）KRAS基因突变105例，突变率48.4%，以第2号外显子突变最常见，其基因突变率为43. 8%（95/217）。第2号外显子中第12号密码子突变率为30.4%（66/217），分别为GGT>GAT突变28例，GGT>GTT突变15例，GGT>GCT突变3例，GGT>TGT突变12例，GGT>AGT突变6例，双突变（GGT>GTT和GGT>GAT）2例。第2号外显子第13号密码子突变率为13.4%（29/217），均为GGC>GAC。第3号外显子和第4号外显子基因突变率均为2.3%（5/217）。（2）NRAS基因突变9例，突变率4.1%，其中第2号外显子突变4例（1.84%），第3号外显子突变5例（2.3%），未发现第4号外显子突变。（3）BRAF V600E突变8例，突变率3.7%。（4）1例（0.5%）患者存在KRAS和NRAS联合突变。
（1）年龄≥60岁结直肠癌患者KRAS基因突变率高于<60岁患者，差异有统计学意义（P=0.033）；其他临床病理特征亚组患者KRAS基因突变率差异均无统计学意义（均P>0.05）（表1）。（2）伴远处转移的结直肠癌患者BRAF V600E基因突变率高于无远处转移患者，差异有统计学意义（P=0.006）；其他临床病理特征亚组患者BRAF V600E基因突变率差异均无统计学意义（均P>0.05）（表1）。（3）所有临床病理特征亚组患者NRAS基因突变率差异均无统计学意义（均P>0.05）（表1）。
不同临床病理特征结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF V600E基因突变情况比较[例（%）]
不同临床病理特征结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF V600E基因突变情况比较[例（%）]
| 临床病理特征 | 例数 | KRAS基因突变 | χ2值 | P值 | NRAS基因突变 | P值a | BRAF V600E基因突变 | P值a | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | |||||||||
| <60 | 103 | 42（40.8） | 4.55 | 0.033 | 4（3.9） | 1.000 | 5（4.9） | 0.482 | |
| ≥ 60 | 114 | 63（55.3） | 5（4.4） | 3（2.6） | |||||
| 性别 | |||||||||
| 男性 | 125 | 61（48.8） | 0.02 | 0.887 | 7（5.6） | 0.308 | 3（2.4） | 0.288 | |
| 女性 | 92 | 44（47.8） | 2（2.2） | 5（5.4） | |||||
| 肿瘤长径（cm） | |||||||||
| <4.5 | 120 | 55（45.8） | 0.70 | 0.402 | 4（3.3） | 0.518 | 3（2.5） | 0.471 | |
| ≥ 4.5 | 97 | 50（51.5） | 5（5.2） | 5（5.2） | |||||
| 肿瘤部位 | |||||||||
| 右半结肠 | 42 | 23（54.8） | 1.27 | 0.530 | 1（2.4） | 0.706 | 2（4.8） | 0.269 | |
| 左半结肠 | 43 | 22（51.2） | 1（2.3） | 3（7.0） | |||||
| 直肠 | 132 | 60（45.5） | 7（5.3） | 3（2.3） | |||||
| 病理类型 | |||||||||
| 腺癌 | 202 | 98（48.5） | 0.02 | 0.890 | 9（4.5） | 1.000 | 6（3.0） | 0.098 | |
| 黏液腺癌 | 15 | 7（46.7） | 0（0） | 2（13.3） | |||||
| 分化程度 | |||||||||
| 中高分化 | 161 | 79（49.1） | 0.12 | 0.733 | 8（5.0） | 0.452 | 6（3.7） | 1.000 | |
| 低分化 | 56 | 26（46.4） | 1（1.8） | 2（3.6） | |||||
| 血管瘤栓/神经侵犯 | |||||||||
| 是 | 57 | 30（52.6） | 0.56 | 0.455 | 5（8.8） | 0.247 | 2（3.5） | 0.934 | |
| 否 | 160 | 75（46.9） | 4（2.5） | 6（3.8） | |||||
| 浸润深度 | |||||||||
| T1~2 | 48 | 26（54.2） | 2.52 | 0.288 | 1（2.1） | 0.211 | 0（0） | 0.354 | |
| T3 | 60 | 24（40.0） | 5（8.3） | 3（5.0） | |||||
| T4 | 109 | 55（50.5） | 3（2.8） | 5（4.6） | |||||
| 淋巴结转移 | |||||||||
| 有 | 108 | 57（52.8） | 1.66 | 0.198 | 4（3.7） | 0.748 | 5（4.6） | 0.499 | |
| 无 | 109 | 48（44.0） | 5（4.6） | 3（2.8） | |||||
| 远处转移 | |||||||||
| 有 | 24 | 15（62.5） | 2.15 | 0.142 | 0（0） | 0.602 | 4（16.7） | 0.006 | |
| 无 | 193 | 90（46.6） | 9（4.7） | 4（2.1） | |||||
| TNM分期 | |||||||||
| Ⅰ~Ⅱ期 | 101 | 44（43.6） | 1.76 | 0.185 | 4（4.0） | 1.000 | 1（1.0） | 0.070 | |
| Ⅲ~Ⅳ期 | 116 | 61（52.6） | 5（4.3） | 7（6.0） | |||||
注：a采用Fisher确切概率法
KRAS和NRAS是由RAS家族成员基因编码的两种GTP酶蛋白，参与表皮生长因子受体（EGFR）的信号转导，调控细胞生长、分化、增殖和存活。BRAF基因为RAF原癌基因家族成员，位于RAS基因下游，是RAS-RAF-MEK激酶通路上的关键成员。结直肠癌患者基因突变率受检测方法、包含的基因位点、样本量的大小及人种的影响[5]。文献[6]报道40%~50%的结直肠癌患者存在KRAS基因点突变，3.8%~7.0%结直肠癌患者存在NRAS基因点突变。在亚洲结直肠癌患者中，BRAF突变率为5.4%~6.7%[7]，其中V600E突变占80%以上，是最常见的BRAF基因激活突变[8]。本研究中KRAS基因突变率为48.4%，为结直肠癌主要的突变基因，其中第2号外显子突变率最高，占KRAF基因总突变的90.5%（95/105），突变位点主要发生在第2号外显子的第12、13位密码子上[9,10]，GGT>GAT和GGC>GAC是最常见的突变类型。本研究中NRAS基因突变率为4.1%，与文献报道基本一致；BRAF V600E突变率为3.7%，略低于文献报道，可能与检测的基因位点类型不同有关。
文献报道中结直肠癌患者KRAS基因突变与临床病理特征的关系的结果差异较大，争议的焦点主要集中在肿瘤位置、性别和年龄上。左、右半结肠癌及直肠癌由于存在胚胎起源、解剖学供应、遗传学及细胞分子特征上的差异，导致二者流行病学和致癌机制不同、靶向治疗效果及预后各异[11,12]。有研究结果显示右半结肠癌KRAS基因突变率明显高于左半结肠癌[13]，本研究中KRAS基因突变率在左、右半结肠癌及直肠癌中分别为51.2%、54.8%、45.5%，差异无统计学意义（P<0.05）。由于右半结肠管腔较宽、距肛缘较远，早期肿瘤不易被发现，导致右半结肠癌体积大、分化差、分期晚、预后差，而与基因状态无相关性[11,14]。本研究中年龄≥60岁结直肠癌患者KRAS基因突变率（55.3%）明显高于年龄<60岁患者（40.8%）（P<0.05），与多数研究一致[5,15,16]，故年龄分层可考虑作为KRAS基因状态无法明确时靶向治疗选择的参考依据[16]。有研究者认为RAS-RAF-MAPK通路可能与性激素相关[17]，KRAS基因突变更易发生于女性患者[18]。本研究KRAS基因突变率在不同性别患者中并无差异，可能与样本选择及人种、地域差异有关。
NCCN结直肠癌诊治指南2019.V1版将BRAF基因与KRAS、NRAS基因提到了同等地位。BRAF V600E突变可导致RAF-MAPK信号通路的持续性激活，引起肿瘤细胞分化、增殖、代谢、生长的改变[9]。研究证实BRAF V600E突变预示着患者不良预后和高复发风险[19]；Margonis等[20]分析了849例患者数据发现，与KRAS基因突变相比，BRAF V600E突变对总生存和无病生存的影响至少增加3倍。本研究中BRAF V600E突变率较低，但伴随远处转移的结直肠癌患者BRAF V600E突变率（16.7%）明显高于无远处转移患者（2.1%）（P<0.05），Ⅲ~Ⅳ期结直肠癌患者BRAF V600E突变率（6.0%）高于Ⅰ~Ⅱ期患者（1.0%），但差异无统计学意义（P=0.070），提示BRAF V600E突变的患者肿瘤恶性程度可能更高，预后较差，与文献报道基本一致。
尽管关于NRAS基因突变的研究较少，但多中心临床试验证实了NRAS基因突变也是西妥昔单抗治疗产生耐药的一种分子标志物，NRAS基因突变的结直肠癌患者不能从抗EGFR药物中获益[21]。Pikoulis等[22]研究显示NRAS基因突变与患者性别相关，男性NRAS基因突变率高于女性，提示女性结直肠癌患者更容易从抗EGFR靶向治疗中获益，其具体分子机制仍有待进一步探讨。本研究中男性NRAS基因突变率为5.6%，女性为2.2%，差异无统计学意义（P>0.05），可能是NRAS基因的突变率较低、检测的病例数还不足以显示出统计学差异所致。本研究中NRAS基因状态与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、血管瘤栓/神经侵犯均无相关性，本课题组将继续增加病例，进一步研究NRAS基因状态与临床病理特征之间的关系。
总之，结直肠癌患者KRAS基因突变位点主要在第2号外显子，年龄与KRAS基因突变相关，伴远处转移与BRAF V600E基因突变相关。本研究为回顾性分析，且病例有限，结果仍有待多中心、大样本、前瞻性研究进一步验证。
所有作者均声明不存在利益冲突
