乳腺癌作为女性发病率最高的恶性肿瘤，寻求除手术治疗、放化疗、内分泌治疗之外的靶向治疗方式显得尤为重要。随着肿瘤免疫治疗的不断探索，越来越多的治疗靶点被挖掘出来。文章就嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）在乳腺癌中的有效作用靶点及其在乳腺癌中的应用进行综述。
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2020年全球乳腺癌新发病例高达226万例，死亡68万例，已超越肺癌成为全球第一大癌症[1]，中国的乳腺癌发病率也在逐年上升。一直以来，肿瘤-宿主免疫相互作用被认为是癌症进展的主要驱动因素[2]。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法已经在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了不错的效果。目前，5种靶向CD19的CAR-T产品已被美国食品药品管理局（FDA）批准用于治疗7种不同的淋巴类恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤等[3]。而对于实体瘤的治疗还主要处在研究阶段，研究人员发现了越来越多的有效靶点可以用于乳腺癌的治疗。
CAR-T是指提取患者外周血中的T细胞，在体外由基因工程技术编码嵌合抗原受体基因（CAR），将其通过病毒等载体嵌合在T细胞上后回输入患者体内的一项免疫治疗的新技术。CAR作为CAR-T的核心成分，由肿瘤相关抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域共同组成。肿瘤相关抗原结合结构域是由单克隆抗体抗原结合区的单链可变片段（scFv）决定的[4]。scFv可以决定CAR的特异性，它会在T细胞遇到特异性肿瘤抗原时与特定抗原结合，直接激活大量的T细胞，刺激大量细胞因子的分泌，从而能够对肿瘤细胞直接进行攻击杀伤。因此，CAR能够使T细胞以不依赖人类淋巴细胞抗原（HLA）的方式识别肿瘤抗原，可以识别比天然T细胞表面受体（TCR）更加广泛的靶抗原。
CAR-T目前已经发展到了第5代，并陆续开展临床试验。最新的第5代CAR-T可以在体外制备异体T细胞，它的优势是利用基因编辑技术设计了可以避免发生免疫排斥反应的基因，根据实验和临床的进展可以随时提供给患者[5]。
理想的肿瘤抗原表位是在癌细胞中高表达的肿瘤特异性抗原，然而在实体瘤中很少表达，迄今为止发现并研究的都是肿瘤相关抗原（TAA）。选择合适的乳腺癌TAA是至关重要的，目前乳腺癌研究中较为有效的靶点包括以下几种：
MUC1是一种自然产生的高度糖基化的跨膜黏蛋白，通常在包括乳腺在内的主要器官的所有腺上皮细胞上表达。MUC1在超过90%的乳腺癌中过度表达和异常糖基化，因此针对MUC1抗体的研究有很多。Roy等[6]研发出一种新型单克隆抗体TAB004，它可特异性识别所有亚型乳腺癌中的异常糖基化肿瘤形式MUC1（tMUC1），包括95%的三阴性乳腺癌（TNBC），同时不会识别正常组织的MUC1。该研究利用TAB004来设计MUC28z融合分子以生成CAR-T细胞。MUC28z包含与CD28和CD3ζ偶联的TAB004的scFv。MUC28z CAR-T对一组人TNBC细胞显示出显著的靶标特异性细胞毒性。结果显示MUC28z CAR-T在体内和体外都有效延缓了TNBC的生长。可以看出MUC28z CAR-T对tMUC1阳性TNBC有很高的治疗潜力，同时很大程度上减少了对正常乳腺细胞的损伤[7]。由于tMUC1在上皮来源的多种实体瘤中表达，所以MUC28z CAR-T疗法也可以在其他实体瘤中进行深入研究。
ROR1蛋白首先被发现在B细胞慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病和套细胞淋巴瘤的一个亚组中均高水平表达，最近有研究发现ROR1蛋白在上皮性癌症的不同组织学亚群中也有表达，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌等。因此，ROR1进入了学者们的研究视野，Balakrishnan等[8]的研究发现，一小部分雌激素受体/孕激素受体（ER/PR）阳性（12% ROR1+）的乳腺肿瘤中存在低ROR1染色，而在HER2阳性肿瘤中ROR1未表达。然而在TNBC中高度表达，57%的样本为ROR1+，其中56%被评为ROR1高表达，74%显示均匀染色。该研究提示ROR1在TNBC中高度表达。随后Wallstabe等[9]通过3D培养的肺癌和乳腺癌模型发现，ROR1-CAR-T细胞能够通过渗透和迁移穿过肿瘤基质，在静态培养条件下给药后至少在72 h内可以保持功能，在动态培养中CAR-T能主动进入动脉介质流并黏附、浸润肿瘤块，深入肿瘤组织并清除位于完整基底膜上下的多层肿瘤细胞。此外，ROR1-CAR-T在动态3D培养中可存活数天，并克服物理和免疫障碍以发挥其抗肿瘤功能。
EGFR是EGFR酪氨酸激酶家族的成员，其突变或过表达可能会导致肿瘤的发生，已被证实在TNBC进展中起着重要作用。Liu等[10]将来自新型抗EGFR抗体的抗EGFR scFv与人工组合的受体分子融合，生成CAR-T以特异性靶向TNBC细胞中的EGFR，证实EGFR特异性CAR-T能够有效识别高表达EGFR的TNBC细胞。结果显示，两种不同类型的活化EGFR特异性CAR-T通过上调细胞因子分泌和促进TNBC的细胞毒性进而在体外和小鼠模型中抑制TNBC肿瘤的生长。之后更多研究证明EGFR是TNBC的相关免疫治疗靶点，Xia等[11]设计的第3代EGFR CAR-T在体外对TNBC细胞的生长发挥了有效和特异性的抑制作用，而对正常乳腺上皮细胞或ER阳性乳腺癌细胞的细胞毒性有限。在异种移植小鼠模型中也得到了进一步证明，EGFR CAR-T表现出针对TNBC的强效和特异性的抗肿瘤活性，表明第3代EGFR CAR-T作为免疫治疗工具在临床上具有治疗TNBC的巨大潜力。
HER2在20%~25%的乳腺癌肿瘤中过度表达，与肿瘤的高复发率和病死率的侵袭性疾病相关。特异性单克隆抗体（曲妥珠单抗）治疗尽管取得了成功，但其耐药性仍是一个不可避免的临床问题，影响了60%~80%的HER2阳性乳腺癌患者的预后[12]。Tóth等[13]的研究证实HER2特异性CAR-T在体内对HER2+曲妥珠单抗耐药的肿瘤异种移植物具有抗肿瘤活性。即使是少量的CAR-T也可以通过聚焦异种T细胞的活性来激发针对抗体抗性异种移植物的强大抗肿瘤反应。Li等[14]生成了以CD28和CD137作为共刺激分子表达第3代HER2 CAR-T的基因修饰T细胞，分别在体外和体内测试了它们单独使用以及联合使用对HER2+曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞的程序性死亡受体1（PD-1）阻断抗体的疗效。结果显示，抗HER2 CAR-T对曲妥珠单抗耐药的乳腺肿瘤具有治疗功效，加入PD-1抗体可以进一步增强治疗效果。这些研究均验证了靶向HER2 CAR-T疗法可以有效解决特异性单克隆抗体的耐药性问题。
NKG2D是一种激活受体，在人类中，它在几乎所有的NK细胞和一些T细胞亚群上表达，如NK/T细胞、CD8+ TCR-αβT、CD4+ T，而在小鼠中，它在NK细胞和活化的巨噬细胞上表达[15]。它可以控制细胞在适应性和先天性免疫中的活动。CAR-NK细胞疗法作为一种新形式的CAR-T疗法备受关注[16]。研究表明[17]NKG2D CAR-T可以在体外有效靶向表达NKG2DL的TNBC细胞，CD27或4-1BB共刺激的CAR-T可以在体内显著抑制体内肿瘤的生长。NKG2D CAR-T治疗可能会为TNBC患者提供治疗的新选择。近年来，关于NKG2D CAR-T的研究也在增多，其在乳腺癌中的应用有待进一步证实。
间皮素是一种在间皮细胞表面表达的细胞黏附糖蛋白，在乳腺癌、间皮瘤、胰腺癌、肺癌和其他癌症中均高表达。其异常表达促进癌细胞增殖、肿瘤侵袭、转移，已成为癌症免疫治疗的一个重要靶点。Tchou等[18]发现Meso CAR-T对高度表达meso的TNBC细胞系显示出细胞毒活性。CAR-T已经被成功地设计成靶向TNBC中的间皮素，并被证明可以诱导体外细胞毒性和细胞因子的产生，以及显著的肿瘤消退[19]。
c-Met是一种酪氨酸激酶受体，c-Met在约52%的TNBC患者肿瘤中过度表达，并且高c-Met表达与更差的无病生存时间和总生存时间相关。c-Met CAR-T可以以靶标依赖性方式介导对肿瘤细胞的强烈细胞毒性，并且这些细胞的杀伤效率与c-Met表达呈正相关。学者们最新发表的关于c-Met CAR-T的研究，构建了一种具有靶向c-Met和PD-1阻断功能的新型双功能CAR-T，发现PD-1阻断功能在体外显著增强了CAR-T。进一步的体内实验证实，在抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠存活方面，双功能CAR-T比传统的单靶点CAR-T具有更强的能力，在肿瘤组织中表现出更强的持久性、有限的抑制性受体表达和更少的分化表型，这使其具有比单靶点CAR-T更强的抗肿瘤功效[20]。与传统的CAR-T相比，具有PD-1阻断功能的双功能CAR-T对实体瘤表现出更高的治疗效果。该研究为CAR-T疗法成功治疗实体瘤提供了新思路。
TEM 8也称为炭疽受体1（ANTXR1），在肿瘤内皮中高度上调，并在包括乳腺癌在内的许多癌症类型中表达。Høye等[21]研究发现TEM8在肿瘤的正常样细胞状态中被上调，并且在肿瘤中显著高于正常乳腺和结直肠组织的细胞状态。使用CRISPR/Cas9工程化TEM8 KO转移性乳腺癌和结直肠癌细胞系进行的实验突出了TEM8在癌症进展、肿瘤血管生成和局部转移中的作用。2018年报道了第一个能够共同靶向TNBC乳腺癌干细胞和肿瘤相关脉管系统的TEM8特异性CAR分子，发现TEM8特异性CAR-T能够杀死TNBC肿瘤实质、肿瘤内皮细胞以及乳腺癌干细胞样细胞，同时可以诱导已建立的TNBC异种移植物的消退[22]。建议将TEM8 CAR-T作为一种有潜在的TNBC靶向疗法。随后Petrovic等[23]研究TEM8 CAR-T时发现一组特异性针对肿瘤内皮标志物TEM8的CAR，当在健康小鼠中测试时，发现了显著的毒性，CAR-T正在识别正常组织上表达的TEM8。尽管肿瘤组织中的TEM8表达水平升高，但正常组织中的表达水平仍然足以让其成为强效药物的靶点，脱靶效应显著。关于TEM8 CAR-T在乳腺癌中的治疗效果还有待更多的实验数据来证实。
CAR-T靶向10多种乳腺癌抗原相关的抗肿瘤活性在体内和体外临床前研究得到了证实，包括AXL、CD32A、CSPG4、EGFR、FRα、GD2、ICAM-1、整合素αvβ3、间皮素、c-Met、MUC1等。当然，CAR-T疗法不可能取代化疗，可以用于乳腺癌的联合治疗，目前联合治疗针对不同的作用机制已被证明是癌症治疗的可行方法。最新完成的Ⅰ期临床试验来自美国宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心，研究表明患者对c-Met CAR-T治疗具有良好的耐受性（NCT01837602）。四川大学华西医院也在招募乳腺癌复发患者参与EpCAM CAR-T疗法用于治疗鼻咽癌和乳腺癌的Ⅰ期临床试验，研究旨在评价EpCAM CAR-T的安全性及评价疗效（NCT02915445）。临床试验中细胞疗法的数量正在持续增长，现有临床试验大多处于Ⅰ期临床研究，大部分患者能够耐受CAR-T的输注，安全性尚且可靠。目前主要存在的治疗障碍有以下几个问题。
（1）抗原逃逸：它使CAR-T细胞对肿瘤细胞无效，主要见于涉及CD19的血液系统恶性肿瘤的临床试验[24]。抗原逃逸在实体瘤的实验研究中也有过相关报道，在胶质母细胞瘤细胞系中靶向HER2导致缺失了HER2的肿瘤细胞出现，这些细胞是维持非靶向的肿瘤相关抗原的表达的重要细胞[25]。目前还鲜见报道在乳腺癌中抗原逃逸的例子，但用CAR-T疗法等特异性靶向疗法治疗的患者，存在这种风险，因此预防和治疗抗原丢失逃逸的方法还需进一步的研究和探索。（2）脱靶效应：指注入体内的CAR-T杀死表达靶抗原的肿瘤细胞，同时杀死表达靶抗原的正常细胞[26]。缺乏特异性抗原增加了靶向肿瘤时的潜在风险，需要寻求在肿瘤上异常或过度表达但在正常组织中不存在或以非常低水平表达的肿瘤靶抗原，以作为实体瘤及其转移的靶点[27]。（3）细胞因子释放综合征：是由快速免疫激活引起的治疗相关毒性，最初表现为发热，进而可发展为伴有缺氧和低血压的危及生命的毛细血管渗漏。目前认为引起临床症状是与T细胞活化和高水平的细胞因子（包括白细胞介素6）相关。
关于如何应对实体瘤中的肿瘤微环境也在进一步的探索中，Xu等[28]研究了一项针对实体瘤的CAR-T疗法专利，该专利使用局部晚期乳腺癌的原位模型，Th/Tc17细胞经STING激动剂DMXAA或cGAMP刺激后产生的CAR-T明显增强了肿瘤的控制，与肿瘤微环境中CAR-T细胞的持久性增强有关。然而，只有在使用STING激动剂的Th/Tc17 CAR-T疗法中加入抗PD-1和抗GR-1单抗才能实现持续的肿瘤消退。该研究提供了增强CAR-T疗法的新方法。
近年来，乳腺癌的研究不断发掘出更多的有效靶点，CAR-T疗法有望在未来成为可靠的治疗方式之一，但也面临诸多挑战，如寻找肿瘤的特异性抗原、减轻CAR-T对正常细胞攻击而产生的脱靶效应、抑制经修饰后的CAR-T潜在的体内免疫排斥反应等，相信随着研究的深入和CAR-T技术的成熟，CAR-T疗法会给难治性乳腺癌患者带来希望。
所有作者均声明不存在利益冲突
