丁杰; 葛美玲; 胡月; 刘艳红; 王晓巍; 高玒

doi:10.3760/cma.j.cn115355-20220801-00496

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SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化检测在早期肺腺癌筛查和诊断中的应用价值

肿瘤研究与临床, 2023,35(3) : 185-192. DOI: 10.3760/cma.j.cn115355-20220801-00496

摘要

目的

探讨SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化检测对早期肺腺癌筛查及诊断的价值。

方法

下载癌症基因组图谱（TCGA）数据库中471例肺腺癌患者的mRNA测序数据及相应的413例甲基化数据分别计算两基因启动子区甲基化水平，分析正常肺组织与肿瘤组织的甲基化水平差异。回顾性分析2018年1月至2019年1月南京大学医学院附属鼓楼医院接受手术的54例早期肺腺癌及31例肺良性肿瘤患者临床资料，检测肿瘤组织及正常肺组织（距肿瘤>5 cm）（称为：临床样本）SHOX2及RASSF1A甲基化状态，以任一基因启动子区甲基化阳性为两基因联合甲基化阳性。以病理诊断为金标准，绘制受试者工作特征（ROC）曲线，分析基因甲基化阳性诊断早期肺腺癌的效能。筛选出石蜡样本中肿瘤细胞比例>80%的患者，对其肿瘤组织及正常肺组织进行mRNA高通量测序。分析两基因甲基化阳性与患者临床病理特征的关系，采用Spearman法分析临床样本和TCGA数据库样本中两基因启动子区甲基化水平与mRNA表达水平的相关性。采用基因集变异分析（GSVA）法分析两基因甲基化阳性临床肺腺癌样本和对应的甲基化阴性肺腺癌样本间京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集通路的差异。

结果

在TCGA数据库中，SHOX2启动子区甲基化岛包含6个被测序的甲基化位点，其中位点cg04532033、cg01557547甲基化水平在肺腺癌组织中均高于正常肺组织（均P<0.05）；RASSF1A基因启动子区甲基化岛包含11个被测序的甲基化位点，其中6个位点的甲基化水平在肺腺癌组织中均高于正常肺组织（均P<0.05）；与正常肺组织比较，SHOX2启动子区甲基化水平在Ⅰ、Ⅱ期肺腺癌组织中升高（均P<0.05）；RASSF1A启动子区甲基化在肺腺癌各期中均处于较高水平（均P<0.001）。在临床54例早期肺腺癌患者中，癌组织SHOX2启动子区甲基化阳性28例，RASSF1A启动子区甲基化阳性21例，两基因联合甲基化阳性40例；31例良性肺结节SHOX2、RASSF1A甲基化均为阴性。ROC曲线分析示，SHOX2启动子区甲基化阳性诊断早期肺腺癌的灵敏度高于RASSF1A启动子区甲基化阳性诊断（51.8%比38.9%），两基因联合甲基化阳性诊断的曲线下面积（AUC）均高于单独以SHOX2或RASSF1A甲基化阳性诊断（0.870比0.759、0.694）。Ⅰ、Ⅱ期肺腺癌SHOX2及RASSF1A甲基化实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测的循环阈值（Ct）均低于正常肺组织（均P<0.05）；与两基因甲基化均阴性患者相比，两基因联合甲基化阳性患者具有年龄更高、肿瘤长径更长、病理分期更晚的特点（均P<0.05）。在临床Ⅰ~Ⅱ期肺腺癌样本中，SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化qRT-PCR检测的Ct与其mRNA相对表达水平均呈负相关（r=-0.43，P=0.003；r=-0.48，P=0.001）；TCGA数据库Ⅰ~Ⅱ期肺腺癌样本中，SHOX2启动子区甲基化水平与其mRNA相对表达量呈负相关（r=-0.23，P<0.001），RASSF1A启动子区甲基化水平与其mRNA相对表达量也有负相关趋势，但无统计学意义（r=-0.05，P=0.310）。两基因启动子区甲基化阳性肺腺癌样本中与叶酸代谢及DNA稳定性相关的通路上调，与血管收缩、细胞生长分化等相关的通路的下调。

结论

SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化联合检测可作为早期肺腺癌筛查、诊断的指标。两基因启动子区甲基化异常可能影响多个肿瘤相关通路，促进早期肺腺癌的发生、发展。

引用本文: 丁杰, 葛美玲, 胡月, 等. SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化检测在早期肺腺癌筛查和诊断中的应用价值 [J] . 肿瘤研究与临床, 2023, 35(3) : 185-192. DOI: 10.3760/cma.j.cn115355-20220801-00496.

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肺腺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的组织学亚型，占肺癌的40%^[1,2]。早期肺腺癌的诊断率并不高，但Ⅰ期肺癌患者总生存率可达85%，远高于晚期患者的15%^[3]。随着基因检测方法的发展，早期肺腺癌中异常的DNA甲基化越来越多地被发现，这些异常甲基化被认为是致癌的重要原因^[4]。这些甲基化主要发生在基因启动子区的甲基化岛上，一些基因（如肿瘤抑制基因）启动子区的高甲基化通常与染色体不稳定及基因沉默有关^[5,6]。因此越来越多的甲基化生物标志物用于肿瘤的早期筛查和诊断^[7,8]。SHOX2和RASSF1A的甲基化检测已在肺癌的临床诊断中得到初步应用^[9,10]。两基因甲基化联合检测在肺泡灌洗液中的检测灵敏度为71.5%~83.2%，特异度为90.0%~97.4%^[11,12]，然而它们在早期肺癌诊断中的价值尚未明确，两者的作用机制仍然有待探讨。本研究分析SHOX2、RASSF1A甲基化对早期肺癌诊断及预后评估的价值，探讨甲基化参与肺腺癌发生、发展的潜在机制。

1　资料与方法

1.1　数据库中肺腺癌SHOX2、RASSF1A甲基化分析

从癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下载471例肺腺癌和59例癌旁正常组织mRNA数据（HTSeq-FPKM）。下载413例肺腺癌和31例癌旁正常组织的DNA甲基化数据，β值表示每个甲基化位点的甲基化水平。分析人类参考基因组GRCh37（hg19）提供的两个基因序列，基于TCGA数据库中启动子区域甲基化岛位点的平均归一化β值，分别计算两基因启动子区甲基化水平，并分析正常肺组织与肿瘤组织间的甲基化水平差异。当甲基化位点的log|FC|>1（FC为差异倍数），错误发现率（FDR）<0.05时，差异有统计学意义。

1.2　临床肺腺癌患者SHOX2、RASSF1A甲基化检测

1.2.1　临床资料

回顾性分析2018年1月至2019年1月我院接受手术治疗的54例早期肺腺癌患者和31例肺良性结节患者资料。所有患者术前CT扫描均提示肺结节，术后病理诊断为肺腺癌或肺良性肿瘤。所有患者手术前均未接受射频消融、化疗或放疗治疗。肺腺癌患者54例中，男性32例，女性22例；年龄（61±10）岁，范围32~72岁；最大肿瘤长径（MTD）（1.73±0.14）cm，范围0.7~4.8 cm。肺良性肿瘤患者31例中，男性16例，女性15例；年龄（55±8）岁，范围40~77岁；MTD（2.15±0.22）cm，范围1.5~4.7 cm。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。本研究获得南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准（批准文号：2013-081-05），所有患者均签署知情同意书。本研究所用样本来源于江苏省科技资源（重大疾病生物样本）统筹服务平台南京鼓楼医院生物样本库。

1.2.2　样本采集及病理学分期、分型

收集患者肿瘤组织及正常肺组织（距离肿瘤> 5 cm）样本，制作石蜡组织并进行切片及苏木素-伊红（HE）染色。由2位病理医师按照2017年国际肺癌研究协会（IASLC）第8版TNM分期标准及2015年世界卫生组织（WHO）肺腺癌分型标准进行分期及分型。肺腺癌患者分期：0期3例，Ⅰ_A期36例，Ⅰ_B期8例，Ⅱ期7例；鉴于肺腺癌高度异质性，以肿瘤中占比最高的成分判定主要组织学分型：原位癌（AIS）3例，微浸润腺癌（MIA）10例，浸润性腺癌（IPA）41例。肺良性肿瘤中，非典型腺瘤样增生12例，纤维组织增生13例，炎性假瘤4例，其他2例。

1.2.3　SHOX2及RASSF1A甲基化检测及结果判读

使用E.Z.N.A FFPE DNA试剂盒（上海Omega公司）提取肿瘤及正常肺组织基因组DNA，使用EZ DNA Methylation试剂盒（北京天漠科技开发有限公司）处理基因组DNA，所有操作过程严格按试剂盒说明书执行。经处理后，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变。使用人SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测试剂盒（上海透景诊断科技有限公司）分别对SHOX2及RASSF1A DNA启动子区甲基化岛的甲基化水平进行检测^[13]。以甲基化的SHOX2和RASSF1A DNA质粒为对照。操作严格按照说明书进行实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）。按照以下标准分析qRT-PCR结果：羧基荧光素（FAM）荧光信号的扩增曲线为光滑的"S"形且循环阈值（Ct）<35时，提示RASSF1A基因甲基化阳性；若Ct≥35，提示RASSF1A基因甲基化阴性。亚磷酰胺（VIC）荧光信号的扩增曲线为光滑的"S"形且Ct<32，提示SHOX2基因甲基化阳性；若Ct≥32，提示SHOX2基因甲基化阴性。当RASSF1A或SHOX2其中之一甲基化结果为阳性时，判定联合甲基化检测结果为阳性；当RASSF1A或SHOX2甲基化结果均为阴性时，判定为联合甲基化检测结果为阴性。

1.2.4　甲基化阳性样本mRNA测序及数据分析

筛选出石蜡样本的肿瘤阳性细胞比例>80%的40例患者，对其肿瘤组织及正常肺组织进行mRNA高通量测序。采用miRNeasy FFPE试剂盒（德国Qiagen公司）提取样本总RNA，去除核糖体RNA并构建文库。在Illumina HiSeq二代测序（NGS）平台上进行测序后，利用基因注释文件完成基因注释，采用FPKM显示每个基因表达谱并用于富集分析。利用基因集变异分析（GSVA）算法分析SHOX2甲基化阳性和RASSF1A甲基化阳性肿瘤组织与对应阴性肿瘤组织之间的京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集通路的差异。当两组间富集通路的log|FC|>0.2且校正P<0.05，差异具有统计学意义。

1.3　统计学方法

采用R4.0.2和SPSS19.0软件进行统计分析。绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析甲基化检测对早期肺腺癌患者的诊断效能，以病理诊断为金标准，采用DeLong检验评估各检测方法的曲线下面积（AUC）差异。计量数据符合正态分布时，以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；计量数据不符合正态分布时，以中位数（范围）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料比较采用χ²检验或Fisher确切概率法。采用Spearman相关性分析法分析两基因甲基化水平与mRNA水平的相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　TCGA数据库样本SHOX2、RASSF1A启动子区甲基化岛位点分析

根据TCGA数据库中甲基化测序数据，分析正常肺组织及Ⅰ~Ⅱ期肺腺癌样本SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化岛的甲基化位点及甲基化水平。SHOX2启动子区内甲基化岛包含6个被测序的甲基化位点，其中位点cg04532033、cg01557547甲基化水平在肺腺癌组织中均高于正常肺组织（均P<0.05）（图1A）。RASSF1A基因启动子区内甲基化岛包含11个被测序的甲基化位点，其中6个位点的肺腺癌组织甲基化水平均高于正常肺组织（均P<0.05）（图1B），包括cg06172942、cg25486143、cg27569446、cg21554552、cg08047457、cg12966367。比较两个基因启动子区甲基化岛平均甲基化水平，Ⅰ、Ⅱ期肺腺癌组织中SHOX2启动子甲基化水平均高于正常肺组织（均P<0.05），Ⅲ、Ⅳ期肺腺癌组织与正常肺组织比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。RASSF1A启动子区甲基化水平在肺腺癌的所有分期都保持较高水平（均P<0.001）（表1）。

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表1

TCGA数据库中肺腺癌组织和癌旁正常肺组织SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化水平比较[中位数（范围）]

表1

TCGA数据库中肺腺癌组织和癌旁正常肺组织SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化水平比较[中位数（范围）]

组别	例数	SHOX2甲基化水平	Z值	P值	RASSF1A甲基化水平	Z值	P值
正常肺组织	31	0.158（0.059~0.190）	-	-	0.109（0.095~0.171）	-	-
肺腺癌
Ⅰ期	243	0.189（0.058~0.652）	-2.82^a	0.004^a	0.165（0.084~0.467）	-4.87^a	<0.001^a
Ⅱ期	108	0.183（0.067~0.587）	-2.32^a	0.022^a	0.183（0.081~0.501）	-4.83^a	<0.001^a
Ⅲ期	69	0.148（0.084~0.635）	-1.14^a	0.254^a	0.158（0.091~0.479）	-4.27^a	<0.001^a
Ⅳ期	20	0.159（0.068~0.529）	-0.64^a	0.533^a	0.195（0.097~0.432）	-4.17^a	<0.001^a

注：TCGA为癌症基因组图谱；甲基化水平以β值表示；^a与正常肺组织比较；-为无数据

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图1

TCGA数据库中正常肺组织和Ⅰ~Ⅱ期肺腺癌组织中SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化岛位点甲基化水平热图　1A：SHOX2启动子区甲基化岛位点；1B：RASSF1A启动子区甲基化岛位点

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注：TCGA为癌症基因组图谱

图1

2.2　早期肺腺癌患者SHOX2、RASSF1A甲基化检测结果及不同分期甲基化水平差异

54例肺腺癌患者中，SHOX2启动子阳性28例，RASSF1A启动子阳性21例，两基因联合甲基化阳性40例；31例良性肺结节患者中，SHOX2、RASSF1A甲基化检测结果均为阴性。

比较0~Ⅱ期肺腺癌组织与正常肺组织SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化Ct。0期肺腺癌组织与正常肺组织的甲基化水平差异无统计学意义，但Ⅰ、Ⅱ期肺腺癌组织Ct均低于正常肺组织，差异均有统计学意义（均P<0.05）（表2）。

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表2

临床收集的早期肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化水平比较（±s）

表2

临床收集的早期肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化水平比较（±s）

组别	例数	SHOX2甲基化Ct	t值	P值	RASSF1A甲基化Ct	t值	P值
正常肺组织	54	38.6±2.1	-	-	39.2±1.1	-	-
肺腺癌
0期	3	36.8±2.0	1.48^a	0.145^a	38.2±0.8	2.09^a	0.147^a
Ⅰ期	44	30.6±5.2	9.63^a	0.001^a	32.7±5.5	7.79^a	<0.001^a
Ⅱ期	7	29.0±4.9	5.18^a	0.002^a	33.6±7.4	2.69^a	0.030^a

注：Ct为聚合酶链反应检测甲基化时的循环阈值；^a与正常肺组织比较；-为无数据

2.3　SHOX2、RASSF1A甲基化阳性诊断早期肺腺癌的效能

SHOX2启动子甲基化阳性诊断早期肺腺癌的灵敏度高于RASSF1A，而两者联合甲基化阳性诊断的AUC均高于单独以SHOX2和RASSF1A甲基化阳性诊断的AUC，差异均具有统计学意义（均P<0.05）（表3）。

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表3

ROC曲线分析SHOX2、RASSF1A启动子区甲基化单独阳性及联合阳性对早期肺腺癌的诊断效能

表3

ROC曲线分析SHOX2、RASSF1A启动子区甲基化单独阳性及联合阳性对早期肺腺癌的诊断效能

组别	AUC（95% CI）	灵敏度（%）	特异度（%）
SHOX2甲基化阳性	0.759（0.654~0.845）^a	51.8	100.0
RASSF1A甲基化阳性	0.694（0.585~0.790）^a	38.9	100.0
两基因联合甲基化阳性	0.870（0.780~0.933）	74.1	100.0

注：ROC为受试者功能特征；AUC为曲线下面积；以病理诊断为金标准；与两基因联合甲基化阳性比较，^aP<0.001

2.4　早期肺腺癌患者SHOX2、RASSF1A甲基化与临床病理特征的关系

两基因联合甲基化阳性组患者具有年龄更高、肿瘤长径更大、病理分期更晚的特点（均P<0.05）；3例0期患者均未检测到任一基因甲基化，随着病理分期升高，两基因联合甲基化阳性率增加（P<0.05）；从AIS、MIA到IPA，阳性率也增加（P<0.05）；两基因联合甲基化阳性的肿瘤组织中具有更高Ki-67阳性表达（P<0.05）（表4）。

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表4

临床获取的早期肺腺癌组织SHOX2及RASSF1A联合甲基化阳性和阴性患者临床病理特征比较

表4

临床获取的早期肺腺癌组织SHOX2及RASSF1A联合甲基化阳性和阴性患者临床病理特征比较

组别	例数	性别（例）		年龄（岁，±s）	MTD（cm，±s）	病理分型（例）			分化程度（例）			病理分期（例）			T分期（例）			淋巴结转移（例）		Ki-67表达（例）
组别	例数	男性	女性	年龄（岁，±s）	MTD（cm，±s）	AIS	MIA	IPA	低	中	高	0期	Ⅰ期	Ⅱ期	0期	T₁期	T₂期	阴性	阳性	阴性	阳性
阳性组	40	23	17	61±9	1.9±1.0	0	5	35	6	17	12	0	34	6	0	29	11	38	2	16	19
阴性组	14	9	5	55±14	1.3±0.7	3	5	6	1	3	8	3	10	1	3	10	1	14	0	11	1
统计量值		χ²＝0.07		t＝2.24	t＝2.61	-			χ²＝3.83			-			-			-		χ²＝7.72
P值		0.797		0.03	0.011	<0.001^a			0.208			0.009^a			0.005^a			0.394^a		0.006

注：MTD为最大肿瘤长径；AIS为原位癌；MIA为微浸润腺癌；IPA为浸润性腺癌；^a为Fisher确切概率法；-为无数据

2.5　早期肺腺癌患者SHOX2及RASSF1A启动子甲基化水平与其mRNA水平的相关性

对临床获取的样本及TCGA数据库数据分析均显示，SHOX2 mRNA在各分期肺腺癌中表达高于正常肺组织，而RASSF1A mRNA在肺腺癌中表达低于正常肺组织（表5、表6）。在临床早期肺腺癌样本中，SHOX2及RASSF1A启动子区甲基化检测的Ct与其mRNA相对表达量均呈负相关，差异有统计学意义（r=-0.43，P=0.003；r=-0.48，P=0.001）。TCGA数据库Ⅰ~Ⅱ期肺腺癌样本中，SHOX2启动子区甲基化水平与其mRNA相对表达量呈负相关（r=-0.23，P<0.001）；RASSF1A甲基化水平与其mRNA相对表达量呈负相关趋势，但无统计学意义（r=-0.05，P=0.310）。

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表5

临床不同分期肺腺癌组织和癌旁正常组织SHOX2及RASSF1A mRNA水平比较[中位数（范围）]

表5

临床不同分期肺腺癌组织和癌旁正常组织SHOX2及RASSF1A mRNA水平比较[中位数（范围）]

组别	例数	SHOX2 mRNA相对表达量	Z值	P值	RASSF1A mRNA相对表达量	Z值	P值
正常肺组织	40	0.800（0.000~3.522）	-	-	18.880（14.110~26.951）	-	-
肺腺癌
0期	3	1.803（0.910~4.887）	-1.63^a	0.110^a	16.432（14.846~18.720）	-1.60^a	0.120^a
Ⅰ期	34	1.389（0.000~8.924）	-2.37^a	0.018^a	16.488（6.043~24.20）	-3.81^a	<0.001^a
Ⅱ期	3	5.425（2.400~7.814）	-2.72^a	0.007^a	15.877（15.000~21.857）	-0.92^a	0.389^a

注：^a与正常肺组织比较；-为无数据

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表6

TCGA数据库中不同分期肺腺癌组织和癌旁正常组织SHOX2及RASSF1A mRNA水平比较[中位数（范围）]

表6

TCGA数据库中不同分期肺腺癌组织和癌旁正常组织SHOX2及RASSF1A mRNA水平比较[中位数（范围）]

组别	例数	SHOX2 mRNA相对表达量	Z值	P值	RASSF1A mRNA相对表达量	Z值	P值
正常肺组织	17	0.042（0.000~0.090）	-	-	10.114（6.689~19.428）	-	-
肺腺癌
Ⅰ期	222	0.158（0.000~6.33）	-4.41^a	<0.001^a	7.518（2.552~19.587）	-3.60^a	<0.001^a
Ⅱ期	92	0.241（0.067~0.587）	-4.79^a	<0.001^a	7.122（2.932~16.610）	-3.88^a	<0.001^a
Ⅲ期	63	0.132（0.010~7.250）	-4.73^a	<0.001^a	6.331（3.117~16.425）	-4.11^a	<0.001^a
Ⅳ期	19	0.158（0.020~7.750）	-2.80^a	0.041^a	7.143（3.5576~19.645）	-3.63^a	<0.001^a

注：TCGA为癌症基因组图谱；^a与正常肺组织比较；-为无数据

2.6　早期肺腺癌患者甲基化阳性样本的富集通路分析

SHOX2甲基化阴性样本相比，SHOX2甲基化阳性肺腺癌样本中与叶酸代谢（一碳叶酸池通路）以及DNA修复（同源重组通路）相关的通路特异性上调，而与血管收缩（血管平滑肌收缩通路）、细胞生长[转化生长因子β（TGF-β）信号通路]等有关的通路特异性下调（图2A）。与RASSF1A甲基化阴性样本相比，RASSF1A甲基化阳性样本中也同样与叶酸代谢（一碳叶酸池通路）、DNA修复（同源重组通路）相关通路特异性上调，而血管收缩（血管平滑肌收缩通路、肌动蛋白骨架的调节通路）、细胞分化及凋亡（MAPK信号通路）以及细胞黏附（黏着斑通路）等通路特异性下调（图2B）。

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图2

临床获取的SHOX2和RASSF1A基因甲基化阳性和阴性的早期肺腺癌样本间KEGG富集通路的GSVA分析　2A：SHOX2甲基化；2B：RASSF1A甲基化

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注：KEGG为京都基因与基因组百科全书；GSVA为基因集分析；TGF为转化生长因子；根据实时荧光聚合酶链反应结果，羧基荧光素（FAM）荧光信号的扩增曲线为光滑的"S"形且循环阈值（Ct）<35，提示RASSF1A甲基化阳性；亚磷酰胺（VIC）荧光信号的扩增曲线为光滑的"S"形，且Ct<32，提示SHOX2甲基化阳性

图2

临床获取的SHOX2和RASSF1A基因甲基化阳性和阴性的早期肺腺癌样本间KEGG富集通路的GSVA分析　2A：SHOX2甲基化；2B：RASSF1A甲基化

3　讨论

随着表观遗传学研究的发展，包括DNA甲基化在内的基因组表观遗传学修饰参与恶性肿瘤的致病机制被揭示。以往研究均表明SHOX2和RASSF1A甲基化检测在肺癌患者外周血、肺泡灌洗液、活检组织检测中均有一定的特异度和灵敏度^[9,11]，但两者对肺腺癌早期筛查和诊断的潜力尚不明确。本研究检测早期肺腺癌及良性肺肿瘤样本SHOX2以及RASSF1A甲基化状态，单一基因甲基化的诊断效能并不高，但联合甲基化检测对早期肺腺癌组织的灵敏度有明显提高。由于本研究中仅有3例0期患者，其检测结果均为阴性，因此两基因甲基化对0期患者的诊断潜力尚不明确。另外联合甲基化检测的阳性率随着年龄增加、临床病理分期进展以及肿瘤浸润深度的增加而增加，与Ki-67表达有一定相关性。有报道认为Ki-67表达与非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖活性呈正相关^[13,14]。这可能提示联合甲基化阳性的早期肺腺癌患者因肿瘤细胞相对增殖较快而迅速进展，应尽早采取积极治疗。

在许多报道中，SHOX2被认为是一个致癌基因^{[15,16,17,18]}。本研究结果发现肺腺癌样本中SHOX2启动子甲基化和mRNA表达水平均升高，但两者却呈负相关，提示SHOX2启动子区高甲基化在一定程度上调控了其基因表达，但这并不是唯一的调控方式，可能还有其他途径导致肿瘤样本中SHOX2表达上调；对TCGA数据库中数据分析显示，SHOX2的甲基化水平在Ⅲ~Ⅳ期肺腺癌中未明显升高，这表明SHOX2启动子区高甲基化是早期肺腺癌的诊断标志物，但可能不适合作为晚期诊断或监测标志物。另一方面，RASSF1A被认为是一个肿瘤抑制基因^{[19,20,21,22]}。本研究两个队列中，RASSF1A启动子区甲基化水平在所有分期的肿瘤样本中均高于正常组织，但其基因的表达水平均低于正常组织，两者呈负相关。无论是RASSF1A的高甲基化还是其较低的mRNA水平都可能成为肺腺癌全期的诊断监测标志物。

SHOX2可抑制骨形态发生蛋白4（Bmp4）基因表达^[18]，后者间接抑制了RUNX相关转录因子2（Runx2）的表达^[15]，Runx2在细胞分化过程中参与TGF-β、血管内皮生长因子（VEGF）介导的调节细胞、血管生长分化过程，并发挥重要作用^[23]。RASSF1A能够直接参与肿瘤细胞的DNA稳定修复、炎症性损伤及肿瘤细胞的迁移和侵袭^[10,19,24]。RASSF1A还与MAPK等多条经典肿瘤通路交联，RASSF1A竞争性地与来自RAF-1-MST2抑制复合物的MST2结合，进而增强RAF-1活性，增强Ras-MAPK通路活性。本研究临床获取的早期肺腺癌样本的测序分析显示SHOX2、RASSF1A甲基化阳性的肺腺癌样本都出现了与叶酸合成及DNA合成、损伤修复相关的功能上调，这可能与肿瘤样本DNA不稳定及高甲基化相关。另一方面，在两者甲基化阳性早期肺腺癌组织中肿瘤细胞黏附性减弱，微环境中的免疫成分减少，血管收缩功能也减弱，提示这些患者的肿瘤微环境已经变得有利于肿瘤浸润，并且更容易发生转移，而对免疫治疗的反应可能也更差。RASSF1A甲基化阳性早癌样本也出现了Ras-MAPK通路的下调，表明RASSF1A启动子区高甲基化及低表达直接影响后者对Ras-MAPK的调节作用，是导致肺癌发生、发展的重要因素之一^[25]。

总之，肺腺癌组织中SHOX2及RASSF1A DNA启动子区甲基化岛甲基化水平在癌早期已出现升高，对早期肺腺癌有良好的诊断效能，能够作为肺腺癌的早期筛查标志物。同时，SHOX2及RASSF1A甲基化与患者体内叶酸代谢异常及DNA不稳定相关，并能导致两基因mRNA表达的异常，后者影响了DNA复制修复、有丝分裂、细胞凋亡、肿瘤免疫等多个环节。然而本研究临床样本数量有限，对于两者甲基化联合检测在早期肺腺癌诊断中的潜力评估尚不完善。同时本研究只针对两个基因启动子区甲基化位点进行了分析，缺少非启动子区甲基化位点甲基化水平的分析，因此这两个基因甲基化异常对其mRNA表达的影响还需进一步探讨，其参与调控肺腺癌发生、发展的机制还需进一步验证。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

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贡献者信息

丁杰

南京大学医学院附属鼓楼医院生物样本库，南京　210008

葛美玲

南京大学医学院附属鼓楼医院生物样本库，南京　210008

胡月

南京大学医学院附属鼓楼医院生物样本库，南京　210008

刘艳红

南京大学医学院附属鼓楼医院生物样本库，南京　210008

王晓巍

南京大学医学院附属鼓楼医院生物样本库，南京　210008

高玒

南京大学医学院附属鼓楼医院生物样本库，南京　210008

通信作者

高玒

Email：gaohong@njglyy.com

关键词

肺肿瘤; 腺癌; DNA甲基化; SHOX2; RASSF1A;

基金项目

江苏省重大疾病生物资源样本库项目（BM2015004）

江苏省重大疾病生物资源样本库开放课题（TC2021B012、TC2021B020、TC2021B021、TC2021B022）

作者声明

作者贡献声明

丁杰：研究实施、论文撰写；葛美玲、王晓巍：样本采集；胡月、刘艳红：数据分析、统计学分析；高玒：研究实施、论文撰写、研究指导、论文修改、经费支持

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2023-03-28

收稿日期：2022-08-01

本文编辑

周薇

本文责任校对

周薇

Original Article

Application value of SHOX2 and RASSF1A gene promoter region methylation detection for screening and diagnosis of early-stage lung adenocarcinoma

Ding Jie, Ge Meiling, Hu Yue, Liu Yanhong, Wang Xiaowei, Gao Hong

Published 2023-03-28

Cite as Cancer Res Clinic, 2023, 35(3): 185-192. DOI: 10.3760/cma.j.cn115355-20220801-00496

Abstract

Objective

To investigate the value of SHOX2 and RASSF1A gene promoter region methylation detection for screening and diagnosis of early-stage lung adenocarcinoma.

Methods

The mRNA sequencing data of 471 lung adenocarcinoma patients and corresponding methylation data of 413 cases were downloaded from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database, the methylation levels of SHOX2 and RASSF1A gene promoter regions were calculated, and the difference in methy lation level between normal lung tissues and tumor tissues was analyzed. The clinical data of 54 patients with early-stage lung adenocarcinoma and 31 patients with benign lung tumors who underwent surgery at Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School from January 2018 to January 2019 were retrospectively analyzed. The methylation status of SHOX2 and RASSF1A in tumor tissues and normal lung tissues (>5 cm from the edge of the tumor foci) (called clinical samples) was detect, and a positive methylation in the promoter region of either gene was considered as a combination of two genes methylation positivity. Using pathological diagnosis as the gold standard, the efficacy of gene methylation positivity in diagnosing early-stage lung adenocarcinoma was analyzed by receiver operating characteristic (ROC) curve. Patients with >80% of tumor cells in paraffin samples were screened, and mRNA high-throughput sequencing was performed in their tumor tissues and normal lung tissues. The relationship between positive methylation of the two genes and clinicopathological features was analyzed, and the correlation between the promoter region methylation level of the two genes and mRNA expression levels in clinical samples and TCGA database samples was analyzed by Spearman method. Gene set variance analysis (GSVA) method was used to analyze the differences in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment pathways between two-gene methylation-positive clinical lung adenocarcinoma samples and corresponding methylation-negative lung adenocarcinoma.

Results

In TCGA database, the SHOX2 promoter region methylation island contained 6 sequenced methylation sites, of which sites cg04532033 and cg01557547 methylation levels were higher in lung adenocarcinoma tissues than in normal lung tissues (both P < 0.05); the RASSF1A gene promoter region methylation island contained 11 sequenced methylation sites, and the methylation levels of 6 of these sites in lung adenocarcinoma tissues were higher than those in normal lung tissues (all P < 0.05). Compared with normal lung tissues, the methylation level of SHOX2 promoter region was higher in stage Ⅰ and Ⅱ lung adenocarcinoma tissues (both P < 0.05); the methylation level of RASSF1A promoter region was higher in all stages of lung adenocarcinoma (P < 0.001). Among 54 patients with early-stage lung adenocarcinoma, 28 were positive for SHOX2 promoter region methylation in tumor tissues, 21 were positive for RASSF1A promoter region methylation, and 40 were positive for combined methylation of both genes; 31 benign lung nodules were negative for SHOX2 and RASSF1A methylation. ROC curve analysis showed that the sensitivity of positive SHOX2 promoter region methylation for diagnosing early-stage lung adenocarcinoma was higher than that of RASSF1A promoter region methylation positivity (51.8% vs. 38.9%), and the area under the curve (AUC) for diagnosis by two-gene methylation positivity was larger than that for diagnosis by SHOX2 or RASSF1A gene methylation positivity alone (0.870 vs. 0.759 and 0.694). The circulating thresholds (Ct) of SHOX2 and RASSF1A methylation tested by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) in stage Ⅰ and Ⅱ lung adenocarcinoma were lower than those in normal lung tissues (all P < 0.05); patients with two-gene methylation positivity were characterized by older age, longer tumor longest diameter and more advanced pathological stage compared with patients with two-gene methylation negativity (all P < 0.05). In clinical stage Ⅰ-Ⅱ lung adenocarcinoma samples, the Ct of SHOX2 and RASSF1A promoter region methylation tested by qRT-PCR was negatively correlated with their mRNA relative expression levels (r=-0.43, P = 0.003; r = -0.48, P = 0.001); in TCGA database stage Ⅰ-Ⅱ lung adenocarcinoma samples, the level of SHOX2 promoter region methylation was negatively correlated with its mRNA relative expression level (r = -0.23, P < 0.001), and the level of RASSF1A promoter region methylation was also negatively correlated with its mRNA relative expression level, but without statistical difference (r = -0.05, P = 0.310). In two-gene promoter methylation-positive lung adenocarcinoma samples, the pathways related to folate metabolism and DNA stability were upregulated, and the pathways related to vasoconstriction and cell growth and differentiation were downregulated.

Conclusions

The combined detection of SHOX2 and RASSF1A promoter region methylation can be used as an indicator for screening and diagnosis of early-stage lung adenocarcinoma. Abnormal promoter region methylation of the two genes may affect multiple tumor-related pathways and promote the occurrence and progression of early-stage lung adenocarcinoma.

Key words:

Lung neoplasms; Adenocarcinoma; DNA methylation; SHOX2; RASSF1A

Contributor Information

Ding Jie