探讨卡培他滨剂量与人源异种移植（PDX）的结直肠癌小鼠模型的疗效、心脏毒性之间的关系。
将1例结直肠癌患者新鲜癌组织移植至免疫缺陷NOG小鼠双腋皮下，建立PDX模型并稳定传代。对原代和第二代肿瘤组织，采用HE染色观察肿瘤组织细胞形态，采用免疫组织化学法检测肿瘤标志物表达情况，以对模型进行评价。小鼠胃灌注200、300、400 mg/kg卡培他滨，1次/d，分别为低、中、高剂量组，每组5只，对照组胃灌注0.9% NaCl溶液；给药14 d，停药7 d，按此方式连续用药。每天测量小鼠体质量，每3 d测量肿瘤体积。观察100 d后，处死小鼠，剖取瘤块，测量肿瘤质量，计算肿瘤体积、肿瘤体积抑制率和抑瘤率，HE染色观察肿瘤组织细胞形态，采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中抑瘤效应指标rasP21、环氧合酶2（COX2）、前列腺素E2（PGE2）及心脏毒性指标心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTn-Ⅰ）、脑钠尿肽（BNP）蛋白水平。
成功构建PDX结直肠癌移植小鼠模型，模型较好地保留了原发肿瘤的组织学特性。给药期间，卡培他滨高剂量组1只小鼠死亡，卡培他滨剂量越高，肿瘤体积增大的速度越慢。至处死小鼠时，4组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）；对剖取的肿瘤组织测量显示，卡培他滨中、高剂量组肿瘤体积和肿瘤质量均较对照组降低（均P<0.05），且随剂量增高降低越明显；低、中、高剂量组肿瘤体积抑制率分别为42.61%、67.61%、77.27%，抑瘤率分别为35.53%、67.77%和75.09%；中、高剂量组血清抑瘤效应指标rasP21、COX2、PGE2蛋白均较对照组降低（均P<0.05），心脏毒性指标cTn-Ⅰ、BNP蛋白水平均较对照组升高（均P<0.05）。
所构建PDX结直肠癌小鼠模型可以较好地保留原肿瘤的组织学特性。小鼠模型经中、高剂量卡培他滨治疗后，抑瘤效果明显，但有造成心肌损害的风险。
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结直肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病初期症状较为隐匿，就诊时患者多处于中晚期，已错过最佳手术治疗时机，因此临床多采用化疗或新辅助化疗方案延缓肿瘤进展，改善局部症状，延长生存时间，以期获得手术机会[1]。卡培他滨是具有高选择性和特异性的新一代氟尿嘧啶衍生物，口服后可经胃肠道黏膜完全吸收，到达癌组织后可转化为有活性的5-氟尿嘧啶[2]，且疗效不亚于其他静脉给药的氟尿嘧啶类药物[3]。人源异种移植（PDX）模型作为药物评价模型越来越受到重视，其能保证肿瘤组织的间质特性，可较好模拟肿瘤在人体内生长的真实情况，对临床前实验研究以及精准医疗的开展有重要的意义[4]。本实验通过建立结直肠癌PDX模型，观察卡培他滨剂量与疗效和心脏毒性之间的关系。
雌性免疫缺陷NOG小鼠，5~6周龄，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[生产许可证号：SCXK（京）2016-0009]，饲养于山西省肿瘤医院实验动物中心屏障环境[实验动物使用许可证号：SYXK（晋）2017-0003]，温度保持在22~25 ℃，相对湿度40%~70%，笼具、饲料、水和垫料均经高压灭菌，每3 d更换1次。肿瘤标本来源于1例接受结直肠癌切除术的67岁女性患者（TNM分期T4bN+M1，Ⅳ期），患者术前未接受放化疗；术后病理诊断为升结肠分化型溃疡性腺癌，侵及肠壁黏膜下层，不累及神经组织。患者同意将肿瘤组织用于本研究，并签署知情同意书。本研究由山西省肿瘤医院医学伦理委员会批准（批准文号：202009）。
DMEM/F-12培养液购自美国Gibco公司，卡培他滨购自江苏恒瑞医药股份有限公司。免疫组织化学使用的甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）和E-钙黏蛋白（E-cad）相关抗体均购自武汉赛维生物科技有限公司。酶联免疫吸附试验（ELISA）所用的小鼠血清脑钠尿肽（BNP）试剂盒、小鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTn-Ⅰ）试剂盒、小鼠环氧合酶2（COX2）试剂盒、小鼠前列腺素E2（PGE2）试剂盒和小鼠rasP21蛋白试剂盒均购自上海泛柯实业有限公司。
将患者新鲜癌组织（原代）置于DMEM/F-12培养液，在冰浴中切成约2 mm×2 mm×2 mm组织块。将2只体质量约20 g、相差小于2 g的雌性NOG小鼠用2%水合氯醛按300~400 µl/20 g体质量麻醉，在双侧腋下肋缘上3~5 mm处去毛，用75%乙醇溶液擦拭，将准备好的原代肿瘤组织块用接种针接种于去毛处皮下，为第1代PDX模型。待第1代肿瘤体积至约1 000 mm3时，麻醉小鼠，在冰浴中剥离肿瘤表面黏液、结缔组织，切开瘤块，剔除坏死部分，获得第1代肿瘤组织，将其按原代瘤块接种方法接种于20只NOG小鼠，即第2代PDX模型，用于药效学研究。
将接种后第2代PDX小鼠按简单随机法分为4组，分别为对照组和卡培他滨高、中、低剂量组，每组5只，待肿瘤体积80~100 mm3时开始给药。卡培他滨高、中、低剂量组每只小鼠分别胃灌注400、300、200 mg/kg卡培他滨0.2 ml，对照组胃灌注0.9% NaCl溶液0.2 ml，1次/d，给药14 d，停药7 d，按此方式连续用药，至处死小鼠。
实验期间，观察小鼠生存状况，每天称量体质量，每3 d测量1次肿瘤体积。若小鼠精神萎靡，活动减少，且体质量下降至18 g以下时，停止给药，视情况适当胃灌注40%葡萄糖溶液0.1~0.2 ml。100 d后采用颈椎脱臼法处死小鼠，剖取瘤块，称量瘤块质量，并计算肿瘤体积、肿瘤体积抑制率和抑瘤率；将原代肿瘤组织和PDX小鼠肿瘤组织用10%中性甲醛溶液固定48 h，常规石蜡包埋，3~5 μm厚切片，HE染色，脱水、固定、密封，显微镜下观察肿瘤组织细胞形态；采用免疫组织化学法检测肿瘤组织AFP、CEA、E-cad的表达，由两位病理学专家采用双盲法进行评定，胞质或胞膜及其邻近部位黄棕色或深棕色颗粒为蛋白阳性，高倍镜下随机选择5个不同视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，根据阳性肿瘤细胞占全部肿瘤细胞的比例进行判断，其中弱阳性为<25%，阳性为25%~75%，强阳性为>75%，阴性为无肿瘤细胞着色；采用摘眼球采血法采集小鼠血液，室温自然凝固15 min，以离心半径8 cm、2 000 r/min离心20 min，收集上清，采用双抗体夹心ELISA法测定血清中抑瘤效应指标BNP、COX2、PGE2和心脏毒性指标cTn-Ⅰ、rasP21，根据标准曲线进行定量。
肿瘤体积=1/2×肿瘤长径×肿瘤短径2
肿瘤体积抑制率（%）=（1-给药组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）×100%
抑瘤率（%）=（1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，用
±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
HE染色显示，第2代PDX模型移植瘤组织细胞形态和结构与原代肿瘤组织相似度较高；免疫组织化学检测显示，模型移植瘤组织和原代肿瘤组织AFP、CEA、E-cad均呈强阳性表达（图1）。提示PDX结直肠癌小鼠肿瘤组织较好地保留了原代肿瘤生物学特性。
实验期间，各组小鼠生存状态良好，外观及采食、饮水正常，卡培他滨高剂量组1只小鼠死亡，解剖未见异常，可能与药物引起的不良反应有关。给药期间，4组小鼠体质量变化趋势一致（图2A），但卡培他滨剂量越高，肿瘤体积增大的速度越慢（图2B）。至处死小鼠时，4组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）；卡培他滨中、高剂量组肿瘤体积和肿瘤质量均较对照组低（均P<0.05），且剂量越高，降低越明显；随剂量增高，肿瘤体积抑制率和抑瘤率均升高（表1）。
注：高、中、低剂量组每只小鼠分别胃灌注400、300、200 mg/kg卡培他滨0.2 ml，对照组小鼠胃灌注0.9% NaCl溶液0.2 ml，1次/d，给药14 d，停药7 d，按此方式连续给药
不同剂量卡培他滨给药100 d后人源异种移植结直肠癌小鼠体质量、肿瘤体积和肿瘤质量比较
不同剂量卡培他滨给药100 d后人源异种移植结直肠癌小鼠体质量、肿瘤体积和肿瘤质量比较
| 组别 | 只数 | 体质量（g， ±s） | 肿瘤体积（cm3， ±s） | 肿瘤体积抑制率（%） | 肿瘤质量（g， ±s） | 抑瘤率（%） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 5 | 24.7±1.7 | 1.8±0.2 | - | 2.7±0.5 | - |
| 卡培他滨低剂量组 | 5 | 25.2±1.1 | 1.0±0.5a | 42.61 | 1.8±0.8 | 35.53 |
| 卡培他滨中剂量组 | 5 | 23.0±1.7 | 0.6±0.3a | 67.61 | 0.9±0.4a | 67.77 |
| 卡培他滨高剂量组 | 5 | 25.3±1.0 | 0.4±0.4a | 77.27 | 0.7±0.7a | 75.09 |
注：卡培他滨高、中、低剂量组每只小鼠分别胃灌注400、300、200 mg/kg卡培他滨0.2 ml，对照组小鼠胃灌注0.9% NaCl溶液0.2 ml，1次/d，给药14 d，停药7 d，按此方式连续给药；与对照组相比，aP<0.05；-为无此项
ELISA检测结果显示，卡培他滨中、高剂量组小鼠血清抑瘤效应指标rasP21、COX2、PGE2蛋白水平均较对照组低（均P<0.05），心脏毒性指标cTn-Ⅰ、BNP蛋白水平均较对照组高（均P<0.05）（表2）。
酶联免疫吸附试验检测不同剂量卡培他滨给药100 d后人源异种移植结直肠癌小鼠血清中与抑瘤效应和心脏毒性相关蛋白表达水平比较（pg/ml，
±s）
酶联免疫吸附试验检测不同剂量卡培他滨给药100 d后人源异种移植结直肠癌小鼠血清中与抑瘤效应和心脏毒性相关蛋白表达水平比较（pg/ml，±s）
| 组别 | 只数 | 抑瘤效应相关蛋白 | 心脏毒性相关蛋白 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| rasP21 | COX2 | PGE2 | cTn-Ⅰ | BNP | ||
| 对照组 | 5 | 8.2±0.5 | 85.8±1.8 | 80.8±5.4 | 37.4±4.4 | 764±37 |
| 卡培他滨低剂量组 | 5 | 8.0±0.2 | 82.2±1.7 | 72.2±3.0a | 43.6±3.3a | 838±26 |
| 卡培他滨中剂量组 | 5 | 7.5±0.2a | 77.6±3.4a | 70.0±2.8a | 43.6±2.3a | 855±15a |
| 卡培他滨高剂量组 | 5 | 7.3±0.1a | 74.3±1.0a | 69.4±2.8a | 44.3±2.8a | 886±36a |
| F值 | 7.34 | 19.47 | 8.81 | 4.03 | 9.54 | |
| P值 | 0.009 | <0.001 | 0.002 | 0.031 | 0.004 | |
注：卡培他滨高、中、低剂量组每只小鼠分别胃灌注400、300、200 mg/kg卡培他滨0.2 ml，对照组小鼠胃灌注0.9% NaCl溶液0.2 ml，1次/d，给药14 d，停药7 d，按此方式连续给药；COX2为环氧合酶2；PGE2为前列腺素E2；cTn-Ⅰ为心肌肌钙蛋白Ⅰ；BNP为脑钠尿肽；与对照组相比，aP<0.05
PDX模型是将来源于人体的新鲜肿瘤组织经处理后移植到免疫缺陷动物体内而建立的，因此PDX模型可以更好地保留原肿瘤组织学特性、基因组特点、细胞异质性和药物反应等生物学特征[5]。本研究对肿瘤组织细胞形态和肿瘤标志物进行观察，验证了PDX瘤组织较好地保留了原始肿瘤组织的细胞形态学特征和分子表型特点，提示成功构建了PDX结直肠癌小鼠模型。本研究结果显示，卡培他滨给药100 d后，高剂量组抑瘤率最高，其次是中剂量组，均明显高于对照组，低剂量组抑瘤率与对照组差异无统计学意义，提示中、高剂量卡培他滨对PDX结直肠癌小鼠有很好的抑瘤效果，有效药物剂量为300~400 mg/kg。
目前认为细胞癌变主要原因是原癌基因激活及抑癌基因失活使细胞内蛋白合成紊乱，细胞的增殖、分化和调节系统失控而使细胞自主性生长[6]。rasP21是ras癌基因家族的一种共同蛋白表达产物，具有与鸟苷酸结合能力和丙氨酸氨基转移酶活性，在细胞膜信号传递、细胞增殖、分化中起重要作用[6]。本研究结果显示，卡培他滨中、高剂量组小鼠血清rasP21蛋白水平均明显低于对照组，提示中、高剂量卡培他滨可使PDX结直肠癌小鼠ras癌基因表达减弱，达到良好的抗肿瘤效果。
研究表明，在消化道肿瘤发展过程中，COX2表达显著增加，抑制COX2表达具有明显的抗肿瘤效应[7,8]。COX2催化花生四烯酸产生中间产物PGH2，PGH2又迅速在各自催化酶的作用下形成PGD2、PGE2、PGF2a、PGI2和血栓素A2（TXA2）。PGE2作为一种花生四烯酸的代谢产物，可以明显促进肿瘤细胞的增殖、迁移等，抑制肿瘤细胞凋亡，降低人体免疫力[9]。因此，以COX2和PGE2为靶点探讨肿瘤诊治的新策略受到关注。本研究结果显示，低、中、高剂量组给药100 d后小鼠血清PGE2水平均明显低于对照组，中、高剂量组血清COX2水平均低于对照组，提示卡培他滨治疗PDX结直肠癌小鼠可能通过抑制花生四烯酸的代谢途径，降低血清中COX2和PGE2水平，抑制肿瘤生长，达到抗肿瘤效果。
卡培他滨为嘧啶类抗代谢药物，近来有研究显示，卡培他滨可以诱发一系列心脏不良反应[10]，与传统5-氟尿嘧啶相比，卡培他滨更容易诱发心脏不良反应[11]。因此为了避免心脏不良事件的发生和预防心脏功能不可逆的损害，监测心肌生物标志物对早期发现心脏损害具有重要意义。BNP是心室肌细胞合成并分泌的心源性激素，在正常生理状态下含量极低，但在心肌缺血时下会明显升高，且与缺血程度呈正相关[12,13]。cTn-Ⅰ是一种心肌调节蛋白，在心肌损伤状态下，心肌细胞通透性增加，导致cTn-Ⅰ迅速释放入血，血清中cTn-Ⅰ水平明显升高[13]。可见，BNP和cTn-Ⅰ可作为预测心肌损伤的敏感指标。本研究中，随卡培他滨剂量升高，小鼠血清BNP、cTn-Ⅰ水平升高，提示卡培他滨对PDX结直肠癌小鼠可能有心肌损害作用，可导致心肌缺血和心肌损伤，但目前其发病机制尚不清楚，可能与动脉痉挛、内皮损伤和毒性代谢物的积累有关[14]。
综上所述，中、高剂量卡培他滨治疗PDX结直肠癌小鼠疗效明显，血清COX2、PGE2及rasP21水平均明显降低，该模型可为其他PDX肿瘤模型应用卡培他滨治疗提供用药参考。同时，本研究还发现PDX结直肠癌小鼠血清BNP、cTn-Ⅰ水平升高，表明卡培他滨存在心肌损伤风险，提示在临床应用卡培他滨过程中应早期加强血清BNP及cTn-Ⅰ的动态监测，适当调整治疗方案及用药剂量。
所有作者均声明不存在利益冲突
