子宫颈癌是妇女因癌症死亡的主要原因，目前尚无可靠的无创指标来预测子宫颈癌的复发、转移及预后。循环肿瘤DNA（ctDNA）是肿瘤细胞释放进入血液循环中的DNA片段，具有无创、实时、可反映肿瘤基因特征的优点。随着ctDNA检测技术的提升和对ctDNA研究的深入，ctDNA在子宫颈癌早期诊断、肿瘤分子分型、治疗监测及预测复发中表现出较传统组织学、血清学和影像学检测方法更明显的优势。文章就ctDNA的检测方法及其在子宫颈癌中的最新研究进展进行综述。
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子宫颈癌是导致妇女因癌症死亡的第4大原因。55%的患者诊断时已为疾病晚期，即国际妇产科联盟（FIGO）分期Ⅱ~Ⅳ期[1]。对于局部晚期子宫颈癌（LACC）的患者，即使接受过放化疗等治疗，在随访期间30%~60%的患者会出现局部和（或）远处复发[2]，因此我们需要探索灵敏的血液生物标志物用于诊断和预测子宫颈癌的预后及复发。随着基因测序技术的迅速发展，以循环肿瘤DNA（ctDNA）检测为代表的液体活组织检查在肿瘤精准医疗中的价值日益凸显。ctDNA检测作为一种新兴的检测手段，在子宫颈癌诊治及预后复发中的临床应用价值正在逐步显现。文章介绍ctDNA在子宫颈癌诊治和预测复发中的研究进展，以期为子宫颈癌诊治开拓新的思路。
有学者在健康人的血液中发现了双链游离的DNA片段，健康人群血液中的循环游离DNA（cfDNA）水平通常不高于100 ng ／ml，而肿瘤患者通常是健康人群的10~40倍[3,4]。Stroun等[5]首次证明了ctDNA的存在，认为ctDNA是cfDNA的一部分，由肿瘤细胞释放进入循环系统，是一种无细胞状态的胞外游离DNA。其主要靠核苷酸酶分解，清除主要依赖肾肝脾的淋巴循环，ctDNA在循环中的半衰期短，约为15 min[4]。ctDNA具有与原发或转移肿瘤相同的遗传物质和表观遗传学改变，因此具有无创评估癌症的潜能。外周血中的ctDNA含量受患者疾病的类型、分期表现出明显的个体化差异，并受到多种内外界因素影响，如急性应激、创伤、手术、炎症、年龄和体力活动等。虽然ctDNA含量在不同癌症患者中差异很大，但在同一患者体内的含量高低趋向于与肿瘤负荷平行[6]，这就为监测肿瘤进展和治疗效果以及疾病预后提供了有力的依据。此外，循环肿瘤细胞（CTC）及肿瘤转移病灶也有助于ctDNA的生成，并指出血液中高CTC与无进展生存（PFS）和总生存（OS）降低相关，其预后价值高于常规成像[7]。ctDNA是液体活组织检查的一种，其他检测物还包括循环稀有细胞（如CTC、祖细胞和成熟内皮细胞或肿瘤培养的血小板）、cfDNA、循环游离RNA（cfRNA）或细胞外囊泡（外泌体）及其载物（包括核酸和蛋白质），最常检测的是ctDNA。
子宫颈癌通常由高危人乳头瘤病毒（HPV）持续感染引起，主要是HPV16和HPV18，其中子宫颈癌病例一半以上是HPV16感染所引起。HPV DNA与人类基因组发生整合是肿瘤发生的关键部分[8]，由于病毒基因序列与人类基因序列不同，血液中HPV DNA的检测可能反映治疗前的肿瘤负担和治疗后随访观察期间的复发转移。由于检测血液中HPV相关DNA精准度更高，与子宫颈癌相关性也更大，最新的研究大多围绕其展开，但这也要求了更为灵敏的检测方法。
肿瘤细胞衍生出的ctDNA数量取决于多种因素，如肿瘤体积或周转率[9]，并且在癌症患者的正常cfDNA背景中，ctDNA的比例通常很小，且因人而异，因此需要超灵敏的方法对ctDNA进行检测[6]。以聚合酶链反应（PCR）分析为基础的检测方法和二代测序（NGS）是ctDNA的主要检测方法。基于PCR的方法主要包括等位基因特异性qPCR（ASqPCR）、数字PCR（dPCR）和BEAMing PCR。其中由dPCR发展而来的高通量的超敏液滴数字PCR（ddPCR）和BEAMing PCR可以识别和量化出现在cfDNA中等位基因频率为0.01%或更低的变化[10]。基于PCR的检测技术只能检测已知基因中的已知突变，不能检测未知突变，而NGS则可通过靶向或非靶向的DNA测序检测所有异常突变。非目标靶向测序NGS没有目标基因，价格昂贵，数据分析难度大，检测深度和检测敏感性方面不如靶向测序方法，故实际应用较少。靶向测序NGS是针对特定基因或特定序列的检测，其中安全测试系统（Safe-SeqS）是在被扩增DNA上标记1个特有的标签后进行扩增，以标签为定位对扩增出来的DNA进行分析，出现频率>95%的基因突变才被认为是真正的突变，使检测误差降低至0.02%。近年应用于NGS的数据统计模型也在发展，如由PyClone改进而来的PyClone-Ⅵ，在保证准确率的情况下显著提高了检测效率[11]。
目前研究中，ddPCR表现更高的灵敏性和特异性，灵敏度0.01%~1%，灵敏度高于定量PCR和NGS，因此有较广泛的应用，但对于子宫颈癌中HPV相关的ctDNA检测，新的检测手段层出不穷。Leung等[12]提供了一种超灵敏的HPV ctDNA定性及定量检测方法，HPV测序（HPV-seq）提高了检测的灵敏度，在dPCR阴性治疗后样本中检测到低至0.03拷贝／ml的ctDNA，为子宫颈癌早期检测和微小残留病（MRD）检测开启了新的大门。Rungkamoltip等[13]建立了基于重组酶聚合酶扩增结合横向流条带（RPA-LF）的HPV16／18 E7和PIK3CA WT内参基因的敏感等温检测方法，RPA-LF检测为在资源有限的环境中检测HPV cfDNA提供了一种可负担、快速、超灵敏的工具。Galati等[14]验证了一种用于HPV16 ctDNA检测的ddPCR替代方法，将基于磁珠的HPV基因分型检测（E7-MPG）的性能与ddPCR DNA检测和HPV16 E6抗体检测的性能进行了比较，E7-MPG检测HPV16阳性子宫颈癌的灵敏度高于ddPCR（74.7%比63.1%，P＝0.001）。由于检测的多重能力，该方法具有降低临床管理成本的潜在优势，从而促进其在临床环境中的使用。
癌症患者的ctDNA含有丰富的肿瘤特征信息，突出了其在临床上的潜在诊断价值，子宫颈癌细胞和HPV DNA存在基因组重组，可以释放到患者的外周血中，因此从诊断监测的角度来看，子宫颈癌患者血液中一致存在的HPV相关的循环DNA可作为子宫颈癌独有的肿瘤标志物。在一项子宫颈癌相关的Meta分析中，结合了10项独立研究的684例子宫颈癌患者用于调查循环HPV DNA的诊断价值，综合阳性似然比（PLR）和阴性似然比（NLR）分别为6.85（95% CI 3.09~15.21）和0.60（95% CI 0.46~0.78），应用受试者工作特征曲线计算曲线下面积（AUC）为0.94（95% CI 0.89~0.99），结果表明子宫颈癌患者血浆中循环HPV DNA对于子宫颈癌诊断具有较好的准确性，可作为肿瘤的无创早期动态生物标志物，但因受研究对象的限制，仍需更大样本量研究来验证诊断的准确性[15]。
最近研究中，ctDNA的诊断价值得到了更加准确的验证。Bønløkke等[16]使用ddPCR检测60例子宫颈癌患者血浆中的HPV cfDNA，在19例晚期患者和3例早期患者中检测到阳性，该结果差异有统计学意义（P < 0.001），说明HPV cfDNA可能不是子宫颈癌早期检测的有效标志物；然而对于晚期子宫颈癌患者，HPV cfDNA水平则能帮助确定肿瘤负担，及早发现晚期患者。另外，该研究通过使用健康对照组的血浆样本，证明了>3拷贝／ml血浆中HPV cfDNA阳性的保守临界值，这为液体活组织检查在子宫颈癌中的临床推广提供了依据。Galati等[14]的研究也有相似的结论，HPV16 ctDNA生物标志物对子宫颈癌的检测具有高度的特异性，在较小的程度上也很敏感，主要适用于处于晚期的肿瘤。该研究证明了使用额外的HPV感染血液标志物，如E6抗体，主要在子宫颈癌早期检测到，可进一步提高子宫颈癌的检出率，当同时考虑HPV16 ctDNA和E6抗体时，HPV16阳性子宫颈癌检测的灵敏度从74.7%增加至86.1%，因此联合多种检测方法可能有更高的检出率。就目前研究来看，对于晚期子宫颈癌患者的诊断，ctDNA有很大的价值，因此继续探索ctDNA仍然具有巨大的潜在意义。
子宫颈癌的常规临床评估和影像学方法不足以准确定义治疗、实时疗效和患者预后，如果能准确发现肿瘤进展高危患者，及时调整治疗方案，比如改变化疗方案或联合靶向治疗等，从而进一步提高子宫颈癌患者的生命质量和生存率，因此仍需开发更为可靠的生物标志物，用于早期发现疾病治疗反应和有效管理评估[17]。ctDNA提供了一种评估各种肿瘤突变特征的无创方法，越来越多地用于肿瘤的精准治疗。已有研究证明HPV相关口咽癌患者的HPV ctDNA快速清除谱可以预测患者接受确定性放化疗（CRT）治疗后的疾病控制，并有助于选择患者对其进行非强化治疗，制订个体化的治疗方案[18,19,20]。在其他类型肿瘤如膀胱癌、乳腺癌和肺癌中已有同样的结论，ctDNA的动态水平与治疗疗效相关，可用于肿瘤的治疗监测[21]。Bønløkke等[16]研究发现HPV cfDNA水平与FIGO分期和肿瘤长径呈正相关（P<0.005），其中肿瘤长径的显著性最高，HPV cfDNA水平在较晚期的疾病分期中检测到最高值，因此对于晚期子宫颈癌患者，HPV cfDNA的定量评估反映了肿瘤负担，可能有助于建立治疗反应和监测疾病，并且可能对检测治疗药物的抗肿瘤活性和子宫颈癌患者缓解期的长期随访有价值[22]。在Cabel等[23]的一项LACC化疗期间的高危HPV ctDNA检测研究中也得到相似的结论，研究分析了55例经CRT治疗的HPV阳性LACC患者的血液和肿瘤样本，显示大多数患者在CRT治疗结束时HPV ctDNA被清除。与活组织检查相比，基于血液的生物标志物具有更大优势帮助治疗分层和疾病监测，可作为活组织检查的替代品，有望成为评估子宫颈癌临床诊治及预后监测的有效指标。
有研究发现存在淋巴结转移、ctDNA高表达和FIGO（2018）Ⅲ期是影响子宫颈癌预后的独立危险因素（P<0.05），而ctDNA高表达又与组织学高分化、浸润间质深度≥1／2、存在淋巴转移和FIGO（2018）Ⅲ期有关[24]。对于LACC，CRT后的挽救性子宫切除通常局限于疑诊残留肿瘤的患者，但是局部复发或转移的高风险患者不易被识别，放射成像结果很难判断，活组织病理检查报告可能记录纤维化和炎症，这使得是否仍有存活的肿瘤细胞存在不确定性[2]。有研究在转移性复发性子宫颈癌（MRCC）确定了5个显著的非同义突变基因（PIK3CA、BRAF、GNA11、FBXW7和CDH1）作为转移性复发显著突变（MSG）基因，观察到ctDNA中的MSG突变的增加比放射学成像更早地反映到疾病进展，该研究发现血浆ctDNA中MSG突变在子宫颈癌晚期或转移性环境中具有预后价值，更多的MSG与2个以上转移位点相关（P＝0.012）且MSG阳性突变是5年PFS率和OS率的显著预测因子[17]。对ctDNA中检测到的基因改变进行连续追踪，可以成为识别早期治疗效果和跟踪获得性耐药的一种信息策略[25]。
Jeannot等[26]前瞻性研究发现，HPV ctDNA检测是预测子宫颈癌复发的有效指标。HPV ctDNA水平与肿瘤中HPV拷贝数呈正相关（P<0.001），治疗结束时HPV ctDNA的完全清除与较长的PFS显著相关（P<0.000 1）。血清中持续存在HPV ctDNA的患者从检测到HPV ctDNA的中位时间为10个月（2~15个月）。等位基因片段偏差（AFD）值是由Tian等[27]新开发的一种用来监测基因组畸变动态变化的算法，研究对93例子宫颈癌血浆cfDNA进行了靶向深度测序，在大多数患者中，cfDNA AFD值在治疗（手术、化疗、放疗或多模式治疗）后倾向于随肿瘤长径的缩小而降低；然而，在cfDNA AFD值没有降低的亚组中，发现了进展性疾病或转移。诊断时AFD值较低，随后AFD值的增加，也可以成功预测疾病的复发[27,28]。在一项LACC化疗后的HPV ctDNA检测研究中发现，在前瞻性队列CRT结束时或随访期间，HPV ctDNA阳性检测与较低的无病生存（DFS）期和OS期相关，表明CRT后残留检测到的ctDNA水平与癌症复发有关，应强调的是需要重复的时间点来提高预测复发的灵敏度，每3~6个月评估1次HPV ctDNA可能是一个合理的随访选择，可以在症状或放射体征出现前预测复发[23]。ctDNA作为早期诊断复发转移的有效指标已在结直肠癌、乳腺癌以及早期肺癌中得到证实，以上关于子宫颈癌研究结果的一致性，说明了ctDNA也是预测子宫颈癌复发和转移一个有价值的标志物。
ctDNA分析已成为无创肿瘤评估的有效手段，可以监测疾病的多个阶段，还可以通过定量检测血液样本中的ctDNA水平或通过检测基因突变来分析整个肿瘤基因组。ctDNA作为一种新的生物标志物，在子宫颈癌的诊断、治疗和预后等方面的研究已初步显示其优越性，未来有望成为子宫颈癌诊疗管理过程中一种补充或替代现有检测方法的新方案。但目前ctDNA提取检测标准尚未统一，ctDNA在子宫颈癌诊治中应用的研究证据尚且不多，未来需要对ctDNA进行更多更深入的临床研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
