探讨血清中期因子(MK)水平在急性白血病(AL)不同发展阶段的意义及其与WT1基因的关系。
用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测86例初治和完全缓解的AL患者组及30名健康对照血清中MK水平；用实时定量PCR法检测其中15例初治急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞中WT1表达量。
初治组血清MK水平(中位数及四分位数)为7.52 ng/ml[(5.44, 10.55)ng/ml]，缓解组MK水平为3.52 ng/ml[(1.56, 5.20)ng/ml]，健康对照组MK水平为2.44 ng/ml[(1.89, 3.12)ng/ml]，初治组较缓解组和健康对照组水平均升高，差异有统计学意义(P<0.01)，缓解组和健康对照组间MK水平差异无统计学意义(P>0.05)。初治B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)组血清MK水平为7.88 ng/ml[(5.78, 15.78)ng/ml]，初治AML中MK水平为6.25 ng/ml[(4.59, 16.33)ng/ml]，两组间差异无统计学意义(P>0.05)；血清MK水平与骨髓中WT1基因表达量间存在相关性(r=0.529 ，P=0.043)。
初治AL患者血清中MK表达水平升高，完全缓解后MK表达水平下降，ELISA法测定血清MK可以作为AL患者病情评价的手段之一；MK与WT1在基因定位上相邻，临床意义相近，并且血清MK和WT1基因在定量上存在相关性。
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中期因子(midkine，MK)是1988年发现的一种肝素结合性生长因子，由于其在小鼠妊娠中期广泛表达，出生后只在肾脏中有表达。后来发现，MK参与了肿瘤的发生和血管生成的调节，并且MK基因在多种实体瘤组织及血液系统肿瘤中高表达。人类MK基因定位于11p11.2，与定位于11p13.2的WT1基因相邻[1]，WT1基因在人类白血病细胞中高度表达，不但对白血病细胞的增殖分化起重要作用，而且与白血病的发生发展和预后有一定关系[2]。我们探讨不同类型、不同阶段急性白血病(AL)患者血清中MK水平及与其骨髓WT1基因定量间的关系，现报道如下。
所有病例为首都医科大学宣武医院血液科于2012年1月至2013年12月诊治的AL患者，共86例，其中男48例，女38例；平均年龄53岁。白血病的诊断依据临床表现、血常规检查、骨髓象及细胞化学染色、免疫分型、染色体及融合基因检测等，所有患者均按照形态学-免疫学-细胞遗传学-分子生物学(MICM)进行评价。初治组46例，男21例，女25例；其中急性髓系白血病(AML)30例，急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)16例；完全缓解组40例，男27例，女13例；其中AML 32例，ALL 8例。完全缓解定义为幼稚细胞少于骨髓有核细胞的5%，外周血中性粒细胞数大于1.5× 109/L，血红蛋白男性大于100 g/L、女性大于90 g/L，血小板计数大于100×109/L。健康对照组选自门诊健康体检者30名，其中男女各15名，平均年龄43.2岁。
所有受试者禁食12 h，采集早晨空腹静脉血5 ml，分别置于不抗凝管内，2 h内以2 000×g离心10 min，分离血清并置于-80 ℃冰箱保存备用：酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(产品货号：E-EL-H2297c)购自武汉Elabscience公司，具体方法：(1)加样，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品及样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。(2)给酶标板覆膜，37 ℃培养90 min。(3)弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100 μl，酶标板加上覆膜，37 ℃培养1 h。(4)弃去孔内液体，甩干，洗板3次。(5)每孔加酶结合物工作液100 μl，加上覆膜，37 ℃培养30 min。(6)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。(7)每孔加底物溶液(TMB)90 μl，酶标板加上覆膜，37 ℃避光培养15 min左右，每孔加终止液50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。(8)立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(A)值。
抽取骨髓血2~ 3 ml(EDTA抗凝)，按照美国Invitrogen公司说明书，用TRIzol提取总RNA，使用Beckman DU-70紫外分光光度计检测总RNA的质量和浓度，测定A260/ A280比值在1.8～2.0之间，并计算RNA含量，取总RNA 2 μg，经反转录酶试剂盒(德国Promega公司)合成cDNA。
使用QIAGEN Rotor-Gene Q型荧光定量PCR仪和TaqMan探针(德国Qiagen公司)，定量检测标本中的融合基因WT1和内参基因ABL的表达量。定量检测结果用目的基因和内参基因拷贝数比值(百分比)表示。
血清MK表达量为非正态分布的计量资料，数据用中位数(M)及四分位数(P25，P75)表示。采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。两组间计量资料比较用2个独立样本的Mann-Whitney U检验，采用Spearman法分析骨髓WT1定量与血清MK表达量的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
初治组(包括AML组和ALL组)MK水平为7.52 ng/ml [(5.44 ，10.55)ng/ml]，缓解组为3.52 ng/ml[(1.56，5.20)ng/ml]，健康对照组为2.44 ng/ml[(1.89, 3.12)ng/ml]，初治组MK水平高于缓解组和对照组MK水平，差异均具有统计学意义(Z=5.373 ，Z=5.478；均P<0.01)。而缓解组MK水平和对照组MK水平，差异无统计学意义(Z=1.846，P>0.05)。
初治B-ALL组血清MK水平为7.88 ng/ml[(5.78，15.78)ng/ml]，初治AML组MK水平为6.25 ng/ml[(4.59，16.33)ng /ml]；两者差异无统计学意义(Z=0.986，P> 0.05)。
初治组患者中有15例同时行WT1基因定量检测，并且均为AML患者。15例患者血清MK水平与骨髓WT1结果见表1，Spearman相关性分析显示，血清MK水平与骨髓中WT1基因定量间存在相关关系(r=0.529 ，P=0.043)。
15例急性髓系白血病(AML)患者血清MK水平与骨髓中WT1基因定量
15例急性髓系白血病(AML)患者血清MK水平与骨髓中WT1基因定量
| 患者序号 | 白血病类型 | 血清中MK水平(ng/ml) | 骨髓WT1定量(%) |
|---|---|---|---|
| 1 | AML-M2 | 10.62 | 15.04 |
| 2 | AML-M2 | 6.55 | 18.25 |
| 3 | AML-M3 | 6.21 | 0.85 |
| 4 | AML-M2 | 7.31 | 6.38 |
| 5 | AML-M5 | 16.79 | 21.68 |
| 6 | AML-M5 | 9.95 | 0.02 |
| 7 | AML-M2 | 5.96 | 1.10 |
| 8 | AML-M2 | 11.94 | 0.83 |
| 9 | AML-M4 | 4.59 | 2.34 |
| 10 | AML-M5 | 19.32 | 16.00 |
| 11 | AML-M2 | 5.78 | 3.21 |
| 12 | AML-M4 | 12.05 | 6.85 |
| 13 | AML-M2 | 15.78 | 8.59 |
| 14 | AML-M5 | 6.76 | 2.10 |
| 15 | AML-M2 | 3.56 | 0.58 |
注：WT1定量为WT1与内参基因ABL表达量的比值
MK基因定位于11p11，由5个外显子和4个内含子组成。在健康成年人组织中，MK在小肠黏膜高表达，在甲状腺中度表达，在肺、结肠、胃、肾及脾组织中微弱表达，而在肝脏未见表达[3]。近几年国内外研究报道，MK在多种人类肿瘤组织中高表达，并参与肿瘤发病过程[4]。由于MK的N末端有信号肽，是一种分泌性肝素结合蛋白，当组织细胞中MK含量达到一定量时，循环系统中MK水平开始升高，可以在血清中被检测到，故MK的血清学研究已经逐渐成为热点。国外研究发现，血清MK的升高与某些实体肿瘤的临床分级和预后密切相关[5]。关于MK基因在血液系统肿瘤中的表达情况，有研究显示，B-ALL及AML-M2型较其他类型水平高[6]。在儿童B-ALL中进展期患者MK基因表达较缓解期患者水平高，差异有统计学意义；T-ALL患者MK水平与健康人差异无统计学意义[7]。本研究发现，AL初治组患者血清MK水平较缓解期和健康对照组升高，差异具有统计学意义，该结果与上述MK基因在AL的不同发展阶段表达情况相近，故ELISA检测方法可以成为临床测定白血病患者MK的新的手段，并且由于血液的采集较骨髓更加方便，因而MK作为一种新的肿瘤标志物的价值更加不容忽视。
近年来，与MK基因相邻的WT1基因在AL的发生、发展及预后判断中的意义越来越受到国内外学者的关注。WT1基因是从Wilms瘤细胞染色体11p13分离出来的一种抑癌基因[8]，诸多研究表明WT1基因表达水平与AL的预后明显相关，在临床上可作为检测微小残留灶的一个标志。但是WT1基因的测定需采集骨髓细胞，在临床中存在一定的不便，也为患者带来一些痛苦。本研究对2例AML患者进行了血清MK的动态监测，结果提示血清MK水平也可以提示缓解与复发，与WT1的临床意义一致，并且通过对血清MK水平与基因结构上相邻的WT1基因水平间的关系的研究发现，它们之间有一定的相关关系。但是，由于仅对15例患者进行了WT1基因的检测，MK与WT1基因表达相关性研究以及具体机制尚需较大样本研究来进一步证实。随着MK的血清学研究越来越受到关注及MK血清学检查成品试剂盒的研究开发，血清MK有望成为AL早期诊断、疗效评价、预后判断的一项新的较好的指标。
