近年来的研究表明，一些基因的拷贝数变异(CNV)与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的进展及预后密切相关。文章结合2015年第57届美国血液学会(ASH)年会上的报道就相关研究进展进行介绍。
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急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤之一，其中B细胞ALL(B-ALL)多见，T细胞ALL (T-ALL)较少见。由于危险分层和化疗方案的改进，儿童B-ALL的长期生存率已由40年前的不到10％提高到85%～90 %，但仍有部分患者出现耐药和复发[1,2,3]。细胞遗传学指标如染色体数目异常、ETV6-RUNX1、BCR-ABL1、MLL融合基因等是目前ALL危险分层的重要依据。
基因拷贝数变异(copy number variations，CNV)也是肿瘤中常见的一类分子异常形式，主要指与基因组参考序列相比，大于1kb的DNA片段的缺失、插入或扩增[4,5]。由于CNV难以通过染色体核型分析、PCR扩增和基因测序检测，一定程度上限制了其研究和应用。随着近十年来基因芯片和新一代基因测序(next generation sequencing，NGS)技术的发展，人们逐渐对ALL患者中CNV的发生情况及病理意义有了更深入的认识[2]。
多项临床研究证明，CNV是儿童ALL中常见的分子异常[2,4,6,7]。大多数CNV是在肿瘤发展过程中继发获得的，并且与细胞遗传学异常有一定的相关性[2]。同一例ALL患者可能同时有多种CNV，它们共同影响疾病的疗效和预后。
2007年，Kuiper等[4]采用高分辨率(250 K)基因芯片分析了40例儿童ALL患者中的CNV，发现57 %的患者携带淋巴细胞分化和细胞周期调控相关基因的CNV。2008年，Mullighan等[6]用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因芯片进行研究，发现初诊儿童B-ALL和T-ALL患者分别平均携带10.8和7.1种CNV。ALL中的CNV以基因缺失多见，基因扩增较少见[8]。
约40%～49％的儿童B-ALL患者携带调节早期B系细胞分化和发育相关基因(PAX5、IKZF1、EBF1、RAG1/2等)的变异，约60％携带细胞周期调控基因(CDKN2A/B、RB1等)的缺失[1,4,6,8]。在一项对1427例B-ALL病例的研究中，Schwab等[7]用多重连接酶依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技术分析了IKZF1、CDKN2A/B、PAX5、EBF1、ETV6、BTG1、RB1、CRLF2、CSF2RA和IL3RA共10种基因的CNV，发现59％的患者至少携带一种基因的CNV，其中以CDKN2A/B和ETV6缺失最多见。
在儿童ALL中，不同基因的CNV与临床表型具有一定的相关性。IKZF1和CDKN2A/B缺失的患儿年龄较大(中位年龄分别为7岁和6岁)，而ETV6缺失多见于2~4岁的患儿，并且与ETV6-RUNX1融合基因显著相关[7]。IKZF1、PAX5和CDKN2A/B缺失的患者白细胞计数较高，常大于50×109/L[7]。
ETV6-RUNX1阳性的ALL患者携带的CNV数目最多，其次是高超二倍体核型、BCR-ABL1阳性和21号染色体内部扩增(intrachromosomal amplification of chromosome 21，iAMP21)的ALL患者，MLL融合基因阳性的ALL患者CNV数目最少[7]。2015年美国血液学会(ASH)年会上，Tomoyasu等[9]报道了用MLPA法分析86种ALL细胞系中8种常见CNV的结果，发现CDKN2A/B和BTG1缺失在BCR-ABL1阳性的细胞系中多见(阳性率分别为100％和57 %)，IKZF1缺失在BCR-ABL1阳性和MLL重排的细胞系中相对多见。
Mullighan等[6]的研究显示ALL复发时的平均CNV数目(14.0个)显著高于初诊时(10.8个)，而且91.8％的复发患者会发生CNV的改变，提示多数ALL患者在复发时发生了克隆演变。在该研究的复发ALL患者中，34％获得了新CNV，12％丢失了初诊时的CNV，而46％在丢失初诊CNV的同时获得了新CNV。
在本届ASH年会上，Pechanska等[10]报道了对147例初诊和70例复发儿童T-ALL患者分析324种基因的研究结果，发现复发标本中CNV的组合发生了显著变化。Yamashita等[11]用全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)对21例复发儿童ALL的克隆演变进行了研究，结果显示IKZF1缺失和CREBBP缺失／突变在复发患者中更多见，可能与化疗药物对肿瘤细胞的选择压力有关。
ALL中常见的可发生CNV的基因有十余种，其中部分CNV的临床意义已研究的较为明确。
iAMP21特指发生于21号染色体内部，包括RUNX1基因在内的约5.1 Mb染色体片段的扩增[2]。伴iAMP21的ALL是近年来新鉴定出的一种具有独特临床特征的ALL亚型[12]。iAMP21发生的主要机制是患者存在第21号染色体的不稳定性，导致发生"断裂-融合-桥循环"，染色体在不断碎裂、修复的过程中发生RUNX1基因所在染色体片段的扩增[13,14]。rob(15; 21)(q10；q10)是先天罗伯逊易位的一种，该异常染色体具有两个着丝粒，在有丝分裂时易被反复拉断和修复。研究显示rob(15; 21)(q10；q10)携带者患iAMP21 ALL的风险是总体人群的2 700倍[15]。
iAMP21可见于约2％的儿童B-ALL，发病平均年龄约9岁，白细胞计数较低，多无其他重现性染色体异常[2,16,17,18,19]。iAMP21 ALL患者用标准方案化疗效果差、复发率高，但采用较高强度的化疗可改善预后[12,16,17,18,19]。
编码细胞周期调节因子的CDKN2A/B基因在染色体上的位置邻近，它们在ALL中常同时发生缺失，但CDKN2A可能是主要的促肿瘤因素[4]。CDKN2A/B缺失见于21%～36.2％的B-ALL和71％的T-ALL，是ALL中最常见的CNV[4,6,7]。47 % BCR-ABL1阳性复发ALL患者有CDKN2A/B缺失，这部分患者的预后更差[19]。
在本届ASH年会上，Xu等[20]报道了BCR-ABL1阳性ALL患者中有CDKN2A/B缺失的预后更差，而且酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)治疗并不能改善预后。他们还发现CDKN2A/B缺失的患者高表达CD20，提示这部分患者可能会获益于利妥昔单抗治疗。
ERG基因缺失主要由异常的V(D) J重组机制介导，多为Exon3~7或Exon3~9所在的约50 kb的基因组片段缺失[21]。ERG缺失的儿童ALL患者常年龄较大，多无重现性细胞遗传学异常，常伴CD2表达异常，常有RAS信号通路的基因变异(62 %)和IKZF1缺失(37.9 %)，但很少有JAK1/2等B细胞发育和分化相关基因的异常[22]。
伴ERG缺失的患者预后良好，即使同时有IKZF1突变的患者预后仍好，8年无事件生存(event free survival，EFS)率和总生存(overall survival，OS)率可达86.4％和95.6 %[2,21]。因此初诊时检测ERG缺失有助于B-ALL的危险分层。但对复发患者的研究显示，ERG缺失并不是非常稳定的基因指标[23]。
IKZF1缺失见于15％的儿童B-ALL，在BCR-ABL1阳性的ALL中可达80 %，在BCR-ABL1样ALL中发生率约40%。IKZF1可为基因全长缺失或部分外显子缺失，Exon4-7缺失的IK6型是最常见的部分缺失基因型[19,24]。IKZF1缺失常为治疗过程中获得的继发突变，是ALL患者的预后不良因素[19]。IKZF1是B细胞分化所需关键细胞因子，IKZF1缺失是导致肿瘤细胞分化停滞于幼稚B细胞阶段的重要机制。但Yu等[25]在本届ASH年会上提出IKZF1还可能是糖皮质激素(glucocorticoid, GC)发挥诱导凋亡作用中的关键决定因子，因此IKZF1缺失可导致地塞米松耐药，从而更适用于加大剂量的化疗方案。
PAX5编码B细胞特异性的转录因子蛋白，是B系细胞发育早期所需的重要基因[19]。29.7％的B-ALL患者有PAX5基因的CNV，多为部分外显子缺失，少数为导致移码突变的Exon2或5的扩增[7,8,26]。ALL患者中还常见PAX5点突变或易位形成的融合基因[19]。PAX5缺失或点突变在B-ALL中发生率虽高，但并无显著的预后相关性[19]。
CRLF2基因位于X/Y染色体短臂的PAR1，编码一种胸腺基质淋巴细胞生成素受体蛋白，参与调控造血细胞的增殖和发育[19]。在B-ALL中，可因PAR1区域的部分缺失导致CRLF2易位到上游的P2RY8基因附近，形成P2RY8-CRLF2易位，易位后的CRLF2基因表达上调。另一种较少见的情况是CRLF2易位到第14号染色体上IGH基因的增强子附近，形成IGH@-CRLF2易位，也可导致CRLF2基因过表达。部分IGH@-CRLF2易位的患者同时有PAR1区域的缺失。由于PAR1缺失和CRLF2易位的关系密切，因此可通过检测PAR1的缺失情况，来间接推断是否发生了CRLF2易位[26]。
CRLF2易位在儿童B-ALL患者中阳性率为5%～7%，较多见于无特征性染色体易位的B-ALL(12.5 %～15.0 %)，在BCR-ABL1样ALL中更多见(约50 %)[19]。在BCR-ABL1样ALL中，CRLF2易位常与IKZF1缺失、JAK1 /2活化突变伴随发生。体外研究显示CRLF2过表达的ALL可获益于JAK激酶抑制剂[19]。
GC是ALL治疗的重要药物，已发现多种基因的缺失与GC耐药有关。编码GC受体蛋白的NR3C1基因缺失见于约28％复发的B-ALL患者，还见于约10%的ETV6-RUNX1阳性初诊ALL患者，与诱导治疗反应差和复发率高有关[27,28]。CREBBP基因缺失或序列变异见于19％的复发B-ALL，可导致GC治疗反应相关基因的转录调控和组蛋白乙酰化异常[29]。BMF基因在GC诱导的细胞凋亡中发挥作用，该基因缺失多见于GC耐药的ETV6-RUNX1阳性ALL患者[27]。BTG1基因也是GC治疗反应的重要决定因子之一，该基因缺失见于约9% B-ALL，在T-ALL中少见[30]。初诊时即存在的BTG1缺失亚克隆可在复发时演变为主克隆，与GC治疗带来的选择压力有关[31]。在2015年的ASH年会上，Scheijen等[32]报道在儿童B-ALL中，BTG1缺失和IKZF1缺失在对复发和预后的影响方面具有协同作用。BTG1和IKZF1基因同时缺失者较单独IKZF1缺失者预后更差，而单独BTG1缺失者预后更好。
Moorman等[26]建立了一套通过整合细胞遗传学指标和8种基因(IKZF1、CDKN2A/B、PAR1、BTG1、EBF1、PAX5、ETV6、RB1)的CNV检测结果，对儿童B-ALL患者进行按遗传学(genetics，GEN)指标进行预后分层的方法。新的GEN分层法仅分为预后好(GEN-good risk，GEN-GR)和预后差(GEN-poor risk，GEN-PR)两组，未保留中危组。该预后分层规则通过809例儿童ALL患者的资料建立，然后用另一研究项目742例儿童ALL患者的资料进行验证，具有很好的重复性和可信性。研究证明对于细胞遗传学指标为高危和低危的患者，其预后预测并不受CNV的影响。GEN分层法的改进主要在于对仅根据细胞遗传学指标不能评估危险度而分为中危组的患者，可根据CNV的情况区分出高危和低危。
根据新的GEN分层法，3/4的初诊儿童B-ALL患者被分入GEN-GR组，5年EFS率可达94 %[26]。该组中第29天时微小残留病(minimal residual disease，MRD)检测>0.01％患者的5年EFS率也超过90%，并且不受化疗方案强度的影响。这提示GRN-GR组患者即使有MRD存在也不需增强化疗。对于这组患者的治疗改进应主要考虑采用更低剂量的化疗方案，以在获得同样疗效的同时，减低药物毒性和长期毒副作用。
约1/4的儿童B-ALL患者被分入GEN-PR组，5年EFS率为79 %[26]。约70％的该组患者无细胞遗传学的不良预后指标，而主要依据CNA的谱型判断为预后差。GEN-PR组患者的治疗转归主要受MRD的影响，但无证据支持进一步增加化疗强度可使这些患者获益。因此对于GEN-PR组患者的治疗改进应关注复发相关的分子机制和新的治疗靶点。
新的GEN分层法可以帮助儿童B-ALL患者更精确地进行预后分层，并且易于开展临床应用。在本届ASH年会上，Patkar等[33]报道了他们对GEN分层法的应用，稍有不同的是增加了iAMP21的检测。他们在报道中也肯定了将CNV列为常规临床检测和预后分层指标具有明确的临床意义。由于Moorman等报道的GEN分层法未涵盖iAMP21、ERG缺失等在B-ALL中具有显著预后相关性的CNV指标，还有一定的改进空间。
儿童B-ALL中大多数CNV的缺失区域小于1 Mb，有的仅为一个或数个外显子的缺失，常规染色体核型分析基本无法检测[8]。染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)法具有较高的检测灵敏度，但只能检测特定的位点，而且分辨率较低[34]。高分辨率的SNP芯片可有效鉴定CNV，并且可分析单亲二倍体，是近几年最常用的进行全基因组CNV分析的工具[4,6,8]。MLPA法可同时分析几种或十几种基因的CNV，具有操作简便、检测成本低的优点，尤其适合临床应用和较大样本量的研究[26]。
反转录聚合酶链反应(RT-PCR)可用以检测某些有对应异常mRNA表达的CNV，如IKZF1缺失的IK6型、ERG缺失、BTG1缺失等，甚至可以实现准确的定量和高灵敏度的MRD监测[31]。但作为MRD监测指标时，应特别注意大多数CNV并不是稳定存在的肿瘤标志，即在复发时有可能丢失初诊时的CNV。
NGS法可同时检测单碱基的序列变异、短片段的插入／缺失和CNV，是分析CNV的最佳方法之一[35]。NGS法检测CNV可有全基因组测序(WGS)、WES、靶向区域捕获或扩增子测序等不同的实现形式。在WGS的平均测序深度为30倍时，几乎可以分析所有长度超过500 bp基因片段的拷贝数变化[36]。近年来越来越多的研究在采用NGS测定序列突变的同时，利用所获得的数据进行CNV分析。本届ASH年会上也有多篇报道中采用了NGS技术研究B-ALL中的CNV[10,11,37]。
遗传学异常是决定儿童B-ALL患者预后的重要因素。CNV是一种特定类型的遗传学异常，在儿童B-ALL中发生率高，对预后判断和指导治疗都有重要的临床意义。联合运用细胞遗传学异常和已经研究的较为明确的CNV指标，可对儿童B-ALL患者进行更精准的预后分层，进一步改善治疗效果。对CNV的进一步研究还有助于发现新的预后指标和潜在的治疗靶点。
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