阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种罕见的获得性造血干细胞基因突变引起的疾病。已明确磷脂酰肌醇聚糖A(PIGA)基因突变是PNH患者血管内溶血的分子病因，但克隆性增殖的机制仍有待揭示。PNH与再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征关系密切。流式细胞术检测锚连蛋白缺陷是诊断PNH的金标准，但基于细胞表型诊断的PNH在病因上仍是一组异质性疾病。依库珠单抗可有效减少PNH血管内溶血，显著改善患者的生命质量，但仍属对症治疗。对PNH发病机制的进一步研究有助于正确认识患者的内在病因、提高鉴别诊断能力和改善治疗。文章对结合近年来的研究进展进行综述。
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阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种罕见的因造血干细胞获得性基因突变导致的疾病，临床表现主要有血管内溶血、骨髓衰竭和反复血栓形成，磷脂酰肌醇聚糖A类(phosphatidylinositol glycan class A，PIGA)基因突变是发生血管内溶血的分子病因[1,2]。PNH最初是按照临床表型命名的疾病，流式细胞术检测CD55、CD59和荧光素标记的气单胞菌溶素(fluorescent aerolysin，FLAER)的应用使其进入了按细胞免疫表型诊断的时代。PNH与再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)等骨髓衰竭综合征的关系错综复杂，常难以正确鉴别诊断。依库珠单抗(eculizumab，EM)通过抑制末端补体活化治疗PNH取得了显著疗效，但仍属对症治疗，存在不能治愈需持续用药、耐药突变等问题[3]。新药的研发也是近年来PNH研究的重点。本文主要介绍PNH的内在病因、诊断和治疗方面的最新研究进展。
PNH是主要依据血管内溶血的相关临床和细胞表型进行诊断的一组疾病，内在病因仍具有异质性。PIGA突变是绝大多数PNH患者的共有特征和血管内溶血的分子病因，但其他基因突变也可导致PNH表型。研究显示PNH有克隆性的证据或迹象，经常与AA、MDS的临床表现和实验室检查相似，其鉴别诊断和克隆性的原因尚未明确。
血细胞表面有十余种抑制补体激活的蛋白质，均通过糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol ，GPI)连接蛋白锚连在细胞膜上，统称为GPI锚连蛋白(GPI-anchored proteins，GPI-AP)，其中最重要的是CD55和CD59[4,5,6]。1994年Bessler等[7]研究显示PIGA基因突变是导致PNH血管内溶血的分子病因。PIGA编码的蛋白参与GPI生物合成的第一步，该基因突变导致GPI合成缺陷。GPI缺陷导致CD55和CD59不能结合到细胞膜上，不能抑制补体活化，因此发生血管内溶血、血红蛋白尿等各种临床表现[8,9,10]。
除最常见的PIGA突变以外，其他基因缺陷导致PNH也偶有报道，如CD59遗传性突变可导致细胞表面CD59缺失，出现慢性血管内溶血、血栓倾向等类似于PNH的临床表现[11,12]。Krawitz等[13]报道1例PIGA突变阴性的PNH患者，在胚系PIGT杂合突变的基础上，继发另一个PIGT等位基因突变而发病。PIGT是GPI转酰胺基酶复合物的组成成分，参与GPI-AP与GPI连接蛋白的结合[14]。与位于X染色体上的PIGA等位基因突变即可导致疾病表型不同，位于常染色体上的PIGT需要2个等位基因突变才可致病。这可能是导致PNH患者中很少检测到PIGT突变的主要原因。
PNH细胞发生免疫逃避的机制可能有多种，如由于PNH细胞缺少GPI锚连的UL16结合蛋白(NKG2D的配体蛋白)，因此可逃避NKG2D阳性的NK细胞和细胞毒性T细胞的杀伤[15]。Gargiulo等[16]发现有些PNH患者体内存在CD1d限制性自身GPI反应性T细胞，而PNH细胞因GPI缺陷可逃避此种免疫杀伤。Gargiulo等[17]报道在免疫性AA患者体内也存在此类T细胞，进一步支持AA-PNH综合征的免疫逃避机制。
免疫逃避部分解释了PNH与AA的密切关系，即60 %~70％的AA患者诊断时存在低比例的PNH细胞，而且大多可持续以亚临床表现存在或存在一段时间后消失[18]。在AA-PNH综合征组织中观察到的PNH细胞可能是在造血减低的背景下，通过免疫选择而被富集下来的具有相同GPI缺陷特征但PIGA突变不同的细胞群，本质上可能不是克隆性的。
2006年Inoue等[18]报道2例PNH患者中同时有第12号染色体易位导致的结构性转录因子蛋白HMGA2表达异常。已知12q13-15染色体易位导致HMGA2异常表达是良性间叶肿瘤的常见分子病因，因此研究者提出PNH是一组在PIGA缺陷的基础上，由第二次突变导致的良性克隆性疾病。Hosokawa等[19]报道PNH表型的粒细胞和单核细胞中CXCR2表达增高。CXCR2是白细胞介素8的受体蛋白，其过表达常见于MDS和急性髓系白血病，是预后不良的因素之一[20]。Hosokawa等[19]未进一步阐明导致PNH细胞CXCR2表达增高的原因，但该发现也提示可能存在促肿瘤形成的因素参与PNH的发生。
近年来，髓系肿瘤中的驱动性突变在PNH中的研究也有报道。2012年Sugimori等[21]报道了3例PNH患者的GPI缺陷克隆同时有JAK2 V617F突变。Katagiri等[22]报道bcr-abl1融合基因也可以作为PNH患者克隆性增生的分子病因之一。这些研究结果进一步支持若PIGA缺陷的造血干细胞继发获得促进细胞增殖的基因突变，则可发展为具有PNH表型的克隆性疾病这一观点，这也可能是10 %~15％诊断时存在低比例PNH细胞的AA患者最终发展为克隆性PNH的分子机制[18]。
2014年，Shen等[23]采用新一代基因测序(NGS)分析了PNH的突变谱，研究其突变累积和克隆演变的过程，提出PNH的克隆演变可能有4种模式：(1) PIGA突变的造血干细胞继发TET2、SUZ12、U2AF1、ASXL1等其他基因突变，发生克隆性增殖；(2) PIGA突变发生于其他促增殖的体细胞突变之后，提供了进一步的生长优势，并且表现出PNH表型；(3)仅有PIGA突变，免疫逃逸仍是这部分患者致病机制的最好解释；(4)PIGA突变克隆与MDS样克隆相互独立存在。
上述模式1和2的PNH患者本质上已经类似于或属于伴PIGA突变的髓系肿瘤或肿瘤前状态。模式3的患者仅可检测到PIGA突变，但并不能排除存在研究者所用方法检测不出的促肿瘤突变的可能性。因此模式3的患者可能是免疫逃逸使非克隆性的PNH细胞被富集的结果，也存在克隆性的可能。模式4的患者可能是在低增生型MDS等造血减低的情况下，PIGA突变的细胞比例相对增高。克隆演化的相关研究显示部分PNH本质上是有PIGA突变的低增生髓系肿瘤或肿瘤前状态。PIGA突变是这些患者发生GPI缺陷和血管内溶血这一共同表型的分子病因，而其他髓系肿瘤相关的突变及演变过程决定了其他的临床特征[23,24,25]。
PNH的诊断需结合临床症状、流式细胞术检测GPI缺陷的细胞，以及其他辅助实验室检查。流式细胞术采用CD55、CD59抗体检测GPI-AP异常，或用FLAER法直接检测GPI异常。FLAER法具有特异性好、灵敏性高、不受输血和溶血影响等特点，被越来越多地推广使用。但FLAER法不能评价红细胞的PNH表型，因此不能完全替代CD55、CD59检测。2008年国际临床细胞学学会年会上召开了PNH检测研讨会，讨论并发表了用FLAER联合单克隆抗体检测GPI-AP缺陷的指南[26]。
国际PNH工作组将PNH分为3种亚型[2]，(1)经典型PNH：有网织红细胞增生、血浆乳酸脱氢酶(LDH)和间接胆红素浓度升高、血清结合珠蛋白浓度减低等血管内溶血的临床和实验室证据，但无其他骨髓衰竭性疾病的证据。(2)继发于或合并发生其他骨髓衰竭性疾病的PNH：有血管内溶血的证据，骨髓形态和细胞遗传学分析可明确PNH是否与AA、MDS或其他骨髓病变(如骨髓纤维化)有关。(3)亚临床型PNH：无血管内溶血的临床或实验室证据，流式细胞术可检测到低比例的PNH细胞(GPI缺陷的粒细胞<10%)。绝大多数亚临床型PNH患者有AA或难治性贫血-MDS。
由上述分型可见第2型和第3型PNH与AA、MDS的关系密切，且三者可能是交叉重叠而非互斥关系。Sugimori等[27]用高灵敏度的流式细胞术法在68％的AA患者中检测到比例为0.005 %~23.1％的PNH细胞。Townsley等[28]在88例初诊的重型再生障碍性贫血患者中发现有30例(34 %)可检测到比例为1％以上的PNH细胞。而25％的MDS患者中可检测到PNH表型的粒细胞(0.01 %~5%)[29]。Winter等[30]报道43％的儿童难治性血细胞减少(最常见的儿童MDS亚型)中有低比例(>0.1 %)的PNH细胞。总体来说，用更高灵敏度的检测方法在AA和MDS患者中检测PNH细胞，阳性率也更高。
健康个体的粒细胞中也普遍存在很低比例(1/50 000~2/50 000粒细胞)的PIGA突变和GPI缺陷的细胞[31,32]，接近于在AA患者中检测到的PNH细胞的比例[27]。健康个体中GPI缺陷细胞的PIGA突变多为细胞生成时随机发生，突变序列各不相同[32]。因此在检测灵敏度的提高带来阳性率的升高之后，我们对基于新技术鉴定的PNH(尤其是低比例PNH细胞者)需进行进一步的认识和理解，如合并AA的PNH患者中低比例存在的PNH细胞，可能是在造血衰竭和免疫逃避的双重因素下被富集的非克隆性细胞群，也可能因获得了第二次突变而发生了克隆性增殖。
通过流式细胞术检测GPI缺陷鉴定的"PNH克隆"在基因水平上可能存在不同的PIGA突变，存在假克隆性的可能。Bessler等[33]最早报道PNH患者不止携带一个PIGA突变。Shen等[23]在36例PNH患者中发现有6例(16.67 %)分别携带2~3种PIGA突变。由于传统的Sanger基因测序法存在单个突变位点的检测灵敏度仅为15 %~20 %、为混合测序结果、操作流程复杂等限制，未能被临床常规应用。近年来新兴的NGS技术可对PIGA基因进行深度测序，显著提高了检测灵敏度，并可进行单分子突变分析。最近Yoshizato等[34]用NGS分析439例AA患者的体细胞突变谱和克隆性造血，仅在7.5％的患者中检测到PIGA突变阳性。Narita等[35]用NGS分析儿童骨髓衰竭综合征患者的基因突变特点，结果显示PIGA突变阳性者仅占2.38%。NGS的应用有助于进一步明确流式细胞术检测到的GPI缺陷细胞群的克隆性本质[23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34]，但PIGA基因所在染色体片段的微缺失／大片段缺失或PIGA基因的内含子突变检测和鉴定仍是难题[36]。
其他的辅助检测技术目前也在研究中。Alaiya等[37]报道用液相色谱联合串联质谱法(LC-MS/MS)进行蛋白质组分析，可对低增生型MDS、AA和PNH进行更客观准确的诊断。该研究发现在骨髓和血浆中分别有107种、218种在这3组疾病中表达有显著差异的蛋白质，单独应用该蛋白质指纹图谱即可明确区分这3类疾病，并可能用于疗效监测。
PIGA突变和补体活化通路的研究为药物研发提供了靶标。EM是一种通过特异性结合C5阻断末端补体活化的单克隆抗体，于2007年获美国食品与药品监督管理局(FDA)批准用于治疗PNH并且取得了很好的疗效[3,38]。但EM仍属针对疾病表型的对症治疗，并不能抑制细胞的克隆性增殖，因此需长期持续使用这种昂贵的药物。而且EM不能改善骨髓衰竭，因此AA伴低比例PNH细胞的患者可能不会获益于EM[39]。大部分经典型PNH对EM反应良好，但仍有25 %~35％的患者依赖红细胞输注[39]。近年来，关于EM疗效不佳的原因、作用于上游补体通路的新药研发，以及针对驱动性突变的靶向治疗的研究均有进展。
C5蛋白的第885位氨基酸在EM的结合中起重要作用。在日本和中国汉族人群中携带的C5 p.R885H变异，及在1例有亚洲血统的阿根廷人中检测到的C5 p.R885C变异，均可影响EM与C5的结合从而导致治疗反应不佳[40]。Langemeijer等[41]又报道了1例无亚洲血统的荷兰PNH患者因携带C5 p. R885S变异而对EM耐药，进一步证实了C5 p.R885的遗传多样性可导致EM的原发耐药。
EM只能抑制末端补体激活，上游补体通路的持续作用也是导致其疗效不佳的重要原因之一。大部分接受EM治疗的患者会因PNH细胞表面C3片段的聚集而表现为轻到中度的血管外溶血[42]。有研究报道补体活化更上游的CR1为遗传性低表达型的PNH患者，更容易对EM治疗反应不佳[43]。Alashkar等[44]报道长期使用EM治疗并有持续高胆红素血症的患者，可能是由于胆汁酸转运体基因变异和持续的血管外溶血所致，因此治疗时应留意相关基因多态性的影响。
Gavriilaki等[45]报道了一种小分子的D因子抑制剂，可特异性地阻断PNH的旁路补体活化途径，并且是首次被报道的可以口服的补体抑制剂。Ricardo等[46]报道了一种合成环肽(RA101495)治疗PNH的临床前期研究成果，RA101495可结合C5并通过变构调节抑制其被分解为C5a和C5b，可完全抑制补体旁路活化导致的溶血，并且具有可皮下注射的方便性。
coversin是一种来源于非洲钝缘蜱唾液腺的重组蛋白，可与C5结合并阻断其裂解为C5a和C5b。Langemeijer等[41]和Ueda等[47]分别报道了coversin用于PNH治疗的研究结果，coversin的作用机制与EM相似，但其与C5的结合位点与EM不同，因此对于因C5基因多态性导致EM耐药的PNH患者，coversin有望成为EM的替代治疗药物。
ALN-CC5是一种通过RNA干扰机制靶向作用于C5的制剂。Hill等[48]报道的Ⅰ期临床研究结果显示ALN-CC5可有效抑制PNH的补体活化，并且具有可皮下注射和给药周期长的特点，有望成为PNH的又一有效治疗手段。
TT30是将人补体受体Ⅱ型的C3d结合结构域和H因子的补体调节结构域相连接得到的重组人源融合蛋白，可阻断旁路途径的补体激活。体外实验证实TT30可有效预防PNH的溶血并抑制C3b介导的调理作用。多中心临床试验结果显示TT30有很好的安全性和耐受性，但还需进一步改进以延长其药理学作用时间[49]。
基于PIGA突变和GPI缺陷认识和分类的PNH是一组异质性疾病，可为非克隆性也可具有克隆性的特征，尤其是与AA及低增生型MDS之间的关系复杂。近年来对PNH分子病因的研究有助于区分理解不同PNH患者的内在病因，以及与AA、MDS等的鉴别诊断，从而给予患者更合适的治疗。NGS深度测序检测PIGA基因突变可能有助于进一步判断PNH细胞的克隆性。针对补体活化途径的新药研发将会为患者用药带来更多选择，以更好地控制血管内溶血及其并发症。而驱动性基因突变的鉴定更是为针对克隆性增殖病因的靶向药物的选择提供了依据，甚至为治愈PNH带来新的希望。
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