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T细胞免疫球蛋白黏液素3基因在急性白血病中的表达及其临床意义
白血病·淋巴瘤, 2016,25(5) : 259-263. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2016.05.002
摘要
目的

探讨T细胞免疫球蛋白黏液素3 (Tim-3）基因在急性白血病患者和白血病细胞株中的表达情况，并分析其临床意义。

方法

收集初治急性白血病患者65例和8株白血病细胞株，同时收集15名健康供体的骨髓作为健康对照，分离单个核细胞，提取DNA，应用实时荧光定量聚合酶链反应检测单个核细胞上Tim-3 mRNA相对表达量，比较不同类型白血病Tim-3 mRNA表达差异，分析急性白血病患者Tim-3 mRNA表达与临床特征的关系。

结果

M3细胞株NB4及非M3细胞株Kasumi-1、HL60、SHI-1、THP-1、Jurkat、CCRF-CEM、Mutz-1 Tim-3 mRNA相对表达量分别为（4.51±0.62）×10-5、（79.22± 2.91）×10-5、（41.14±3.01）×10-5、（27.70±3.50）×10-5、（60.47±4.97）×10-5、（10.44±1.77）×10-5、（42.80± 2.95）×10-5、（11.68±1.96）×10-5。非M3细胞株Tim-3 mRNA表达水平均高于NB4细胞株（均P<0.05）。非M3型急性髓系白血病（AML）患者Tim-3 mRNA相对表达量为（27.64±13.35）×10-4，AML-M3患者为（4.81±2.30）×10-4，急性淋巴细胞白血病（ALL）为（32.09±23.42）×10-4。其在非M3型AML和ALL中的表达水平高于健康对照[（12.02±4.22）×10-4]，差异有统计学意义（P<0.05），非M3型AML和ALL患者的Tim-3 mRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。在非M3型AML中，根据法、美、英协作组（FAB）分型，Tim-3 mRNA在AML-M4中的表达水平高于其他类型AML (P<0.05）。不同性别、年龄、骨髓原始细胞数、初诊白细胞数的急性白血病患者间Tim-3 mRNA表达水平差异均无统计学意义（均P>0.05）。

结论

Tim-3 mRNA高表达于非M3型的急性白血病患者和细胞株，其表达水平与初治急性白血病患者的性别、年龄和原始细胞数无关。

引用本文: 徐良静, 徐金格, 李晓莉, 等.  T细胞免疫球蛋白黏液素3基因在急性白血病中的表达及其临床意义 [J] . 白血病·淋巴瘤, 2016, 25(5) : 259-263. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2016.05.002.
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急性白血病是一类高度异质性血液系统恶性肿瘤，近几年发病率呈逐年上升趋势，其病因和发病机制复杂，是多因素共同作用的结果。T细胞免疫球蛋白黏液素3 (Tim-3）是近年来备受关注的一个重要负性共刺激分子，是Tim基因家族成员之一，该基因定位于人类染色体5q33.2，编码Ⅰ型膜蛋白[1]。Kikushige等[2]发现大多数急性髓系白血病（AML）患者（除急性早幼粒细胞白血病，即除M3型）的白血病干细胞（LSC）表面高表达Tim-3，而在正常的造血干细胞表面不表达，因此Tim-3有可能成为潜在的清除AML LSC的治疗靶点。近期研究显示，Tim-3可以异位表达于肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、子宫颈癌等，其表达水平上调与实体瘤的发生、发展相关[3,4]。Tim-3基因在成年人急性白血病中的表达特点及临床意义目前尚鲜见报道。本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测Tim-3基因在急性白血病细胞株及成年人急性白血病中的表达，并探讨其临床意义。

1　资料与方法
1.1　研究对象

收集2015年1月至8月于我院血液内科住院及门诊就诊的初治急性白血病患者65例。包括AML 50例，急性淋巴细胞白血病（ALL）15例；男性30例，女性35例，中位年龄42岁（18~ 72岁）。50例初治AML中，M0 1例，M1 8例，M2 13例，M3 10例，M4 12例，M5 5例，M6 1例。15例ALL中，T-ALL 3例，B-ALL 12例。以15名健康骨髓移植供者或体检者作为健康对照，包括男性6名，女性9名，中位年龄36岁（21～ 46岁）。上述标本采集均经患者家属知情同意后实施。诊断采用形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学（MICM）诊断模式，形态学根据法、美、英协作组（FAB）分型法细则进行分型；免疫分型参考我国诊断标准和欧洲白血病免疫学分型协作组（EGIL）抗原积分系统[5]。

1.2　实验方法
1.2.1　细胞培养

髓系白血病细胞株包括Kasumi-1、HL60、NB4、SHI-1、THP-1；淋系白血病细胞株包括Jurkat、CCRF-CEM、SIL-ALL、Mutz-1。所有白血病细胞株均由江苏省血液学研究所保存。除SHI-1细胞接种于含10％灭活小牛血清的IMDM培养液中外，其余细胞株均接种于含10％灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养，每2～ 3 d换液，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2　RNA提取及cDNA合成

取骨髓标本，采用Ficoll密度梯度法分离骨髓单个核细胞，按照TRIzol（美国Invitrogen公司）法提取总RNA，经1.5％琼脂糖凝胶电泳确定为完整RNA，用紫外分光光度仪测定其吸光度（A）260/A280比值均大于1.8，计算RNA含量。用六随机引物100 ng、M-MLV酶（美国Promega公司）200 U反转录成cDNA。

1.2.3　RT-qPCR检测Tim-3基因表达

利用SYBR GreenⅠ染料在ABI荧光定量PCR仪上检测Tim-3基因的表达。Tim-3上游引物：5'-CTG CTGCTACTACTTACAAGGTC-3' ；下游引物：5'-GCAGG GCAGATAGGCATTCT-3'。内参β-actin上游引物：5'-ACTGGGACGACATGGAGAAA-3' ；下游引物：5'-TAGC ACAGCCTGGATAGCAA-3'。反应体系：cDNA 1.5 μl、上下游引物各0.5 μl、2× SYBR mix 10 μl，加双蒸水至20 μl。PCR采用两步法进行，反应条件：95 ℃，10 min预变性；95 ℃ 15 s, 60 ℃退火延伸1 min，共40个循环。反应完毕后，将扩增的每份PCR产物进行熔解曲线分析，判断是否为特异性产物。每个样本的Tim-3和β-actin mRNA的检测均做3个平行管以保证结果的准确性，取平均值。目的基因相对表达水平以2-△Ct计算。

△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因

1.3　统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，方差齐性检验采用Levene检验，两组独立样本之间的比较采用双尾t检验，多重独立样本之间的比较采用方差分析法（one-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　Tim-3基因PCR产物的特异性分析

熔解曲线显示，Tim-3和β-actin的PCR产物均呈较锐的单峰，熔解温度分别为79.79 ℃和88.14 ℃，熔解温度均一。熔解曲线中没有其他杂峰，提示扩增产物具有特异性，无引物二聚体及非特异性产物。随机抽取标本的RT-qPCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果显示均呈单一条带（图1），目的基因Tim-3与内参基因β-actin的PCR产物分别位于75 bp和188 bp，无其他杂带，进一步证明了反应的特异性。

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图1
实时荧光定量聚合酶链反应检测急性白血病患者T细胞免疫球蛋白黏液素3 (Tim-3）基因表达
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M: marker; 1~ 4：急性白血病患者；5、6：健康对照

图1
实时荧光定量聚合酶链反应检测急性白血病患者T细胞免疫球蛋白黏液素3 (Tim-3）基因表达
2.2　Tim-3基因在急性白血病细胞株中的表达

NB4、Kasumi-1、HL60、SHI-1、THP-1、Jurkat、CCRF-CEM、Mutz-1细胞株Tim-3 mRNA相对表达量分别为（4.51±0.62）×10-5、（79.22±4.91）× 10-5、（41.14 ± 3.01）× 10-5、（27.70 ± 3.50）× 10-5、（60.47 ± 4.97）× 10-5、（10.44 ± 1.77）× 10-5、（42.80 ± 2.95）× 10-5、（11.68 ± 1.96）× 10-5。表达最高的为Kasumi-1细胞，表达最低的为NB4细胞。非M3细胞株（Kasumi-1、HL60、SHI-1、THP-1、Jurkat、CCRF-CEM、Mutz-1）Tim-3 mRNA表达水平均高于M3 （NB4）细胞株（t值分别为26.15、20.56、11.30、19.35、5.59、22.00、6.04，均P<0.05）（图2）。

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图2
各急性白血病细胞株T细胞免疫球蛋白黏液素3 (Tim-3）基因表达情况
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1 ：NB4; 2：Kasumi-1; 3: HL60; 4: SHI-1；5：THP-1 ；6：Jurkat; 7: CCRF-CEM; 8: Mutz-1

图2
各急性白血病细胞株T细胞免疫球蛋白黏液素3 (Tim-3）基因表达情况
2.3　Tim-3基因在健康对照和急性白血病患者骨髓中的表达

15名健康对照者Tim-3 mRNA相对表达量为（12.02±4.22）×10-4。在除AML-M3外的55例急性白血病患者中，Tim-3 mRNA相对表达量为（28.85 ± 15.36）×10-4。非M3型AML、ALL、AML-M3患者Tim-3相对表达量分别为（27.64 ± 13.35）× 10-4、（32.09 ± 23.42）×10-4、（4.81±2.30）×10-4。非M3型AML和ALL患者Tim-3 mRNA表达水平均高于健康对照（t= 4.43，P<0.05；t=3.27，P<0.05），AML-M3患者低于健康对照（t=4.92，P<0.05），但非M3型AML和ALL相比，Tim-3 mRNA表达水平差异无统计学意义（t= 0.89 ，P>0.05）。初治AML中，M0、M1、M2、M4、M5、M6的Tim-3 mRNA相对表达量分别为10.11 × 10-4、（16.74±10.52）×10-4、（27.85±13.94）×10-4、（40.01± 8.93）× 10-4、（31.13 ± 15.78）× 10-4、13.72 × 10-4。其中，M4较除M3型外的其他分型AML Tim-3 mRNA表达水平[（22.37±14.89）×10-4]高，差异有统计学意义（t=3.78，P=0.01）。ALL患者中，T-ALL的Tim-3 mRNA相对表达量为（34.92±20.55）×10-4，B-ALL为（31.35 ± 25.34）× 10-4，两者差异无统计学意义（t= 0.25，P>0.05）。

2.4　Tim-3基因表达与初治急性白血病患者临床特征的关系

初治非M3型急性白血病患者Tim-3 mRNA表达水平在不同性别、年龄、骨髓原始细胞比例、初治白细胞数亚组间差异均无统计学意义（均P>0.05）（表1）。

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表1

T细胞免疫球蛋白黏液素3 （Tim-3）基因表达与初治非M3型急性白血病患者临床特征的关系（×10-4）

表1

T细胞免疫球蛋白黏液素3 （Tim-3）基因表达与初治非M3型急性白血病患者临床特征的关系（×10-4）

临床特征例数Tim-3 mRNA相对表达量统计量值P值
性别    
 男2428 04±13.75t= 0.240 61
 女3129 14±19.42
年龄（岁）    
 <604127 95±18.63t= 0.64042
 ≥601431 48±15.17
白细胞计数(×109／L)    
 <1004628 23±15.70t= 0.610 53
 ≥100931 76±17.82
原始细胞比例(%)    
 20～491025 75±14.53  
 50～792530 37±16.69F= 0.120 89
 ≥802032 16±18.85  
3　讨论

急性白血病是由于造血干、祖细胞在较早阶段发生增殖失控、凋亡受阻、分化障碍而引起的一组造血系统恶性肿瘤。AML是一组在形态学、细胞遗传学、免疫分型、分子生物学及临床特征上均存在显著差异的异质性疾病[6]。近年来随着化疗方案的改进及造血干细胞移植技术的发展，小于65岁AML患者完全缓解（CR）率可达70%～80 %，但缓解后复发率仍较高，国外学者认为是LSC对化疗药物耐药所致[7,8]。

Tim-3在2002年第一次被发现，定位于染色体5q33.2，编码Ⅰ型膜蛋白，是T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子家族的一员，主要表达于Th1细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞中，在肿瘤免疫监视逃逸中扮演了重要角色[9,10]。其配体为半乳凝素9 (Gal-9），这是一种广泛表达的可溶性分子，受到干扰素γ （IFN-γ）的调节。当Tim-3与Gal-9相互作用后，促进Th1细胞凋亡，CD8+ T细胞功能缺失，伴随IFN-γ生成减少，从而间接抑制免疫反应[11,12]。近期研究显示，除免疫细胞外，Tim-3可以异位表达于非造血细胞的肿瘤细胞，特别是原发性癌细胞，包括非小细胞肺癌、子宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤等[3,4,13,14]。Tim-3在黑色素瘤细胞中表达可使肿瘤细胞黏附力降低，促进肿瘤进展[14]。Tim-3在胃癌细胞中的高表达与患者预后呈负相关[15]。国外学者发现，Tim-3高表达于除M3的大多数亚型AML干细胞中，更重要的是，Tim-3在正常造血干细胞中几乎不表达，且Tim-3阳性LSC的前凋亡基因BAX和SIVA明显下调，提示Tim-3阳性LSC极可能是功能性LSC[2,16]。

本研究发现Tim-3 mRNA在Kasumi-1细胞株中表达最高，在NB4细胞株中表达最低。且Tim-3基因在Kasumi-1、HL60、SHI-1、Jurkat等非M3型细胞株中表达水平均高于M3型细胞株（NB4）。我们还发现Tim-3基因在非M3型急性白血病患者中表达，但非M3型AML和ALL组间差异无统计学意义。Tim-3 mRNA在M4中的表达较其他AML高。由于本研究样本量较少，没有发现急性白血病患者Tim-3 mRNA表达水平在不同性别、年龄、骨髓原始细胞比例、初诊白细胞数亚组间有差异（均P>0.05）。由于随访时间偏短，本研究没有对患者的生存和复发情况进行统计分析，我们将继续扩大样本量，延长随访期，进一步分析Tim-3基因表达与预后的关系。

综上所述，本研究发现Tim-3基因表达于非M3型急性白血病中，其异常表达可能是成年人急性白血病发生、发展的一个重要因素。但考虑到白血病是一类高度异质性疾病，Tim-3基因在不同类型白血病患者中的差异、作用机制及能否成为一个新的白血病治疗靶点，尚需进一步深入研究。

利益冲突
利益冲突

无

参考文献
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