探讨WT1基因与急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）患者预后的关系及其用于微小残留病（MRD）监测的可能性。
收集58例初发AML、32例初发ALL、40例AML-完全缓解（CR）、28例ALL-CR患者及31例同期三系增生活跃患者（对照组）骨髓单个核细胞，利用荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测WT1基因的表达，建立WT1基因在各组间的表达阈值，以WT1拷贝数/ABL拷贝数×100%表示WT1基因的相对表达量。
初发AML患者与对照组间WT1基因中位相对表达量差异有统计学意义[20.880%（3.550%~48.500%）比0.026%（0~0.240%），Z=-7.74，P<0.000 1]。AML-CR患者[0.102%（0~5.380%）]与初发AML患者间WT1基因中位相对表达量差异有统计学意义（Z=-8.34，P<0.000 1）。此外，WT1基因表达高于阈值（20.880%）的AML患者第1个疗程CR率为60.7%（17/28），而表达低的患者为76.7%（23/30）。AML患者复发时WT1表达升高。与对照组相比，初发ALL患者WT1基因中位相对表达量[0.350%（0.021%~10.780%）]升高（Z=-2.58，P<0.05），但与ALL-CR患者[0.038%（0~2.800%）]相比，WT1基因中位相对表达量差异无统计学意义（P=0.065）。
WT1基因在AML中的表达相对较高，其可能成为AML患者预后评估及MRD监测的有效指标，但并不适用于ALL患者。
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WT1基因定位于人类染色体11p13上，是具有抑癌和致癌双重作用的转录因子[1]。1994年Pritchard-Jones等发现骨髓中CD34+细胞表达WT1，且WT1表达水平与原始细胞百分比有很大的关联性，表明造血系统恶性肿瘤的发生、发展与WT1基因的异常表达密切相关[2,3]。近年研究发现，WT1基因表达与白血病的发生、发展相关，其表达升高还可用于预测复发[4,5]，但各研究使用的WT1表达检测方法不一，导致各检测结果及WT1表达率很难比较。本研究利用商品化试剂盒检测WT1表达并建立其阈值，以评估WT1表达与急性白血病患者预后的关系，探讨其用于微小残留病（MRD）监测的可能性。
选取2014年6月至2016年5月在我院诊治的158例急性白血病患者标本，包括98例急性髓系白血病（AML）和60例急性淋巴细胞白血病（ALL）。所有患者均经骨髓细胞学、免疫表型、染色体和融合基因检测，符合国内现行白血病分型标准。AML患者中，初发患者58例，其中M2型25例，M4型20例，M5型8例，M6型5例，中位年龄45岁；完全缓解（CR）患者40例，其中M2型20例，M4型12例，M5型8例，中位年龄38岁。ALL患者中，初发患者32例，均未分型，中位年龄11岁；CR患者28例，均未分型，中位年龄8岁。初发AML患者采用DA方案治疗，初发ALL患者采用VDLP方案治疗。以同期31例三系增生活跃的患者作为对照。
常规抽取患者髂骨或腰椎骨髓2~4 ml，EDTA抗凝，以人淋巴细胞分离液收集骨髓单个核细胞，0.9% NaCl溶液洗涤，然后在适量单个核细胞中加入1 ml TRIzol，充分吸打，混合均匀后加入200 μl三氯甲烷，充分振荡混匀，13 000×g离心15 min，取上清液，加入预冷的500 μl异丙醇，混匀后低温高速离心10 min，倒掉上清液，用DEPC-H2O+75%乙醇洗涤后，加DEPC-H2O溶解至适当浓度备用。
WT1基因定量检测试剂盒由上海源奇生物医药科技有限公司提供，应用ABI 7500型荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR检测，按照试剂盒说明书操作，每次试验均设阴性对照和阳性对照标准曲线，并同时进行内参基因ABL拷贝数的定量检测。以WT1拷贝数/ABL拷贝数×100%表示WT1基因的相对表达量。
采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析，各组间WT1基因的相对表达量不满足正态分布，以中位数（范围）描述，采用秩和检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
58例初发AML患者WT1基因中位相对表达量为20.880%（3.550%~48.500%），31例对照组患者为0.026%（0~0.240%），两者差异有统计学意义（Z=-7.74，P<0.000 1）。初发M2、M4、M5和M6型AML患者WT1基因中位相对表达量分别为11.850%（4.581%~38.670%）、12.230%（3.550%~42.341%）、11.680%（4.013%~35.496%）和12.080%（3.724%~48.500%），各亚型间的表达量差异均无统计学意义（均P>0.05）。40例AML-CR患者WT1基因的中位相对表达量为0.102%（0~5.380%），与初发AML患者比较，差异有统计学意义（Z=-8.34，P<0.000 1）（图1）。24例初发ALL患者WT1基因中位相对表达量为0.350%（0.021%~10.780%），与对照组相比，表达量升高（Z=-2.58，P<0.05），但与ALL-CR患者[0.038%（0~2.800%）]比较，差异无统计学意义（P=0.065）（图1）。
对照：三系增生活跃患者；AML：急性髓系白血病；ALL：急性淋巴细胞白血病；CR：完全缓解；WT1基因相对表达量以WT1拷贝数/ABL拷贝数×100%计算
将AML初发患者WT1基因中位相对表达量20.880%定为该方法检测AML WT1基因的表达阈值。58例AML患者中28例WT1基因表达量高于该阈值，其第1个疗程CR率为60.7%（17/28），而30例WT1表达低于该阈值的患者第1个疗程CR率为76.7%（23/30）。此外，对3例初发AML患者（1例M2，2例M4）进行WT1跟踪检测，结果显示患者CR时WT1基因表达量均降低到初发时的10%以下，而复发时其表达量又急剧升高，均升高70倍以上。
3例不同分型复发急性髓系白血病患者各时期WT1基因相对表达量
3例不同分型复发急性髓系白血病患者各时期WT1基因相对表达量
| 序号 | 分型 | 初发（%） | 完全缓解（%） | 复发（%） | 复发/完全缓解 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | M2 | 6.82 | 0.38 | 30.40 | 80.0 |
| 2 | M4 | 3.72 | 0.35 | 24.59 | 70.3 |
| 3 | M4 | 5.66 | 0.21 | 27.40 | 130.5 |
注：WT1基因相对表达量以WT1拷贝数/ABL拷贝数×100%计算
WT1基因最初是从儿童肾脏Wilms瘤细胞中分离出来的，近年研究表明其在造血细胞的生长和分化过程中发挥重要作用[6]。秦亚溱等[7]研究发现，WT1基因在白血病细胞中的表达高于正常骨髓细胞，91%的初治AML患者可以检测到WT1基因表达，但不同患者之间表达差异很大。不同研究中WT1的表达是否一致以及怎样比较其表达是利用WT1对白血病患者进行预后评估的重要前提。本研究采用商品化试剂盒检测并建立各组患者间WT1表达阈值，以方便各研究者间进行结果比较。
本研究结果显示，对照组WT1基因中位相对表达量为0.032%，而初发AML和初发ALL患者分别为20.880%和0.350%，初发AML患者中该基因表达高出对照组100多倍，且AML各分型间WT1基因表达差异无统计学意义，与秦亚溱等[7]研究的结果一致。虽然初发ALL患者WT1基因中位相对表达量较对照组高10倍，但明显低于AML患者，且初发ALL和ALL-CR患者间差异无统计学意义。Zhang等[8]对儿童白血病的研究表明，WT1表达是儿童AML复发和MRD监测的有效指标，但并不是儿童ALL有效的MRD监测指标，与我们的研究结果相似。这些结果提示WT1基因可能与髓系细胞分化相关，而对淋巴细胞分化的影响较小。
与WT1基因表达较高的初发AML患者相比，WT1基因表达较低或不表达者具有较高的CR率、较长的无病生存期和总生存期；而在WT1基因表达较高的AML患者中，随着该基因表达水平的增高，CR率下降，无病生存期和总生存期缩短[9,10]。本研究以初发AML患者WT1基因中位相对表达量为阈值，WT1基因表达量较高的AML患者第1个疗程CR率为60.7%，而WT1基因表达量较低的患者为76.7%，与Steinbach等[9]的研究结果相符。此外，本研究中初发AML和AML-CR患者WT1基因中位相对表达量分别为20.880%和0.102%，后者表达显著降低。提示WT1基因表达量可作为AML患者的预后评估指标，其表达显著降低或升高可辅助预测AML患者的缓解或复发。
WT1基因表达是AML不良预后和较短总生存期的独立预测因子，且是早期复发的预测指标[11]。Malagola等[12]的研究表明，WT1表达还可用于移植后AML患者的复发预测。在本组3例复发的病例中，复发时WT1的表达量较CR时均升高了70倍以上，其中1例患者形态学结果显示有复发趋势但还未达到血液学复发。提示WT1基因表达量可能是AML患者MRD监测及复发预测的有效指标，比形态学检测复发可能有更高的灵敏性，与Yoon等[13]对骨髓增生异常综合征的研究结果一致。
总之，在一些无特定融合基因的AML中，检测WT1表达可有效评估AML患者的预后，并可作为MRD的有效预测指标进行跟踪监测。如果WT1急剧升高（如升高>70倍）提示有复发风险。
无
