第一代蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ）已广泛应用于临床，其主要通过竞争性结合蛋白酶体β5亚基、抑制蛋白酶体功能来干扰细胞内蛋白质降解过程，从而诱导肿瘤细胞凋亡。自2000年美国食品和药品监督管理局（FDA）批准BTZ用于治疗多发性骨髓瘤（MM）以来，MM患者的缓解率及长期生存率得到了明显提高，但在疾病终末期多数患者仍面临耐药复发的问题。因此，探讨BTZ耐药机制、寻找克服BTZ耐药的用药策略是MM治疗的一大挑战。本文就近年来多项关于MM中BTZ耐药机制的相关研究进展进行综述。
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多发性骨髓瘤（MM）是浆细胞恶性克隆性疾病，其主要特征之一是为MM细胞分泌大量单克隆免疫球蛋白。蛋白酶体作为降解细胞内蛋白质的主要复合酶，其正常运转是保持细胞内蛋白质稳态所必需的。因此，针对蛋白酶体的靶向治疗可以通过破坏细胞稳态导致细胞凋亡。硼替佐米（BTZ）是首个获美国食品和药物监督管理局（FDA）批准用于MM治疗的蛋白酶体抑制剂，通过竞争性抑制26S蛋白酶体糜蛋白样活性，干扰细胞内蛋白质代谢，从而影响细胞存活。BTZ的应用极大改善了MM患者的缓解率及长期生存。但是，多数患者在疾病后期不可避免地面临药物耐药以及疾病复发。自BTZ问世以来，有多项研究致力于其耐药机制的分析并积极寻求克服耐药的治疗方法。
UPS是蛋白质降解系统，负责降解细胞内多种重要蛋白质，在维持细胞各项稳定状态等方面发挥重要作用。该系统由泛素分子（Ub）、泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、蛋白酶以及去泛素化酶（DUB）组成，其中蛋白酶体负责降解蛋白质[1]。以下为蛋白质降解过程：（1）Ub活化：Ub被E1激活后，转运至E2上；（2）蛋白质泛素化：E3识别底物蛋白后，Ub分子从E2转移至底物蛋白；（3）多次重复上述过程后，底物蛋白与多个Ub形成短链；（4）去泛素化及蛋白质降解：与泛素链相连的底物蛋白被蛋白酶体识别后，在DUB的作用下与Ub分离。在蛋白酶体的作用下，底物蛋白被降解为7~9个氨基酸的短肽片段（图1）。
E1：泛素活化酶；E2：泛素结合酶；E3：泛素连接酶；Ub：泛素分子；ATP：三磷酸腺苷；AMP：磷酸腺苷
蛋白酶体分为组成型蛋白酶体和免疫蛋白酶体。真核生物中最普遍存在的26S组成型蛋白酶体由1个20S催化亚基和2个19S调节亚基组成圆桶状结构。其中，19S调节亚基位于两端，负责识别、去折叠及去泛素化已被泛素标记的蛋白质；20S催化亚基位于中间，两端的α亚基为结构性蛋白，起门控作用；中间两环各含7个β亚基，具有水解活性。具有水解活性的β亚基分为β1亚基（PSMB6，胱天蛋白酶样活性）、β2亚基（PSMB7，胰蛋白酶样活性）和β5亚基（PSMB5，糜蛋白酶样活性）[1]（图2）。
免疫蛋白酶体结构与之类似（11S调节亚基取代19S亚基，β1i、β2i和β5i亚基分别取代β1、β2和β5亚基），主要负责向主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子提呈抗原肽[2]。
BTZ作用于蛋白酶体β5亚基（主要）和β1亚基的S1特异性结合口袋，并通过抑制核因子κB抑制因子（I-κB）、促凋亡蛋白Noxa等重要蛋白质的降解，参与调控细胞增殖和凋亡。BTZ的细胞杀伤作用主要涉及以下通路，（1）核因子κB（NF-κB）通路：非活化状态下的NF-κB与I-κB以结合态存在于细胞质；当Iκ-B被UPS降解，NF-κB得以游离活化并转入细胞核内，发挥其转录因子的作用。BTZ抑制I-κB的降解及NF-κB通路的活化，从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。（2）内源性细胞凋亡通路：BTZ通过升高bcl-2家族中Noxa、Bim等促凋亡蛋白以及降低Mcl-1等抗凋亡蛋白，激活线粒体介导的内源性细胞凋亡通路。（3）未折叠蛋白反应（UPR）：大量未折叠及错误折叠蛋白的积累使细胞内质网超负荷，诱导内质网应激（ERs）后，内质网分子伴侣GRP78/Bip、内质网应激蛋白（CHOP）以及X盒-结合蛋白-1（XBP-1）等蛋白表达增加，触发细胞凋亡[3]。另外，BTZ可以扰乱细胞周期，调节蛋白的代谢，干扰细胞增殖分化[4]。
多项研究证实，在多种BTZ耐药细胞系（淋巴瘤细胞系[5,6]、单核/巨噬细胞系[7]、淋巴母细胞淋巴瘤/白血病细胞系[8,9]、MM细胞系[10,11]）中，存在蛋白酶体β5亚基编码基因PSMB5的点突变。多项研究均发现了Ala49Thr（A49T）突变[7,8,9,10,11]，并证实该突变位点位于S1特异性结合口袋。其他突变位点（C52F、T21A、M45V、M45I等）亦位于S1结合口袋附近[10]。一些突变位点（Thr21Ala、Ala49Thr和Ala50Val）[12]直接参与S1结合口袋与BTZ结合，另一些（Cys52Phe、Met45Ile、Met45Val）[10,12]则在空间构象上接近S1结合口袋，因侧链体积变大、骨架分子移位等间接影响S1与BTZ结合。Groll等[12]通过计算机结构模型展示，以上位点构成了位于β5亚基S1结合口袋附近的集中突变区域。Lü等[8]向亲代Jurkat B细胞系转染G322A突变基因得到Jurkat-mPSMB5细胞系，发现转染细胞系中BTZ的细胞毒作用、凋亡诱导作用及蛋白酶抑制作用均下降，从而证实PSMB5突变可能与BTZ耐药相关。Ri等[11]的转染结果与之相似。然而进一步比较发现，转染细胞系（PSMB5-t KMS-11）耐药程度低于经BTZ诱导后的子代KMS-11/BTZ耐药细胞系。据此，Ri等认为耐药表型不完全由PSMB5点突变决定，可能存在其他机制。某些耐药MM细胞系[6,13]和耐药MM患者样本[11,14]中并没有发现上述基因突变也侧面印证了这一点。因此，PSMB5突变在各个试验中的差别是否因各个细胞系基因组不稳定性差别、耐药基因亚克隆产物不同、不同细胞系所需耐药诱导期长短各异以及BTZ给药方案不一等因素而产生，还需要更多试验加以验证。
多项发现PSMB5点突变的研究亦检测到蛋白酶蛋白表达水平及其水解活性不同程度的上调[5,6,7,8,9]。除此之外，Fuchs等[5]还发现这类耐药细胞系中存在免疫蛋白酶β5i亚基表达的下调，故认为亚基类别转换（β5i亚基向β5亚基转换）也参与了BTZ耐药，但该小组并未进一步研究PSMB5基因水平与转录水平的改变。Niewerth等[15]以干扰素γ（IFN-γ）作用于亲代细胞系后发现β5i亚基转录和翻译水平上调；同时细胞对蛋白酶体抑制剂（BTZ、卡非佐米和ONX0914）的敏感性增强；以siRNA敲除β5i则再次诱导细胞耐药。据此Niewerth等认为β5i亚基下调是BTZ耐药的主要机制，应用IFN-γ诱导其上调或可恢复耐药细胞系对BTZ的敏感性。
此外，蛋白酶体蛋白的成熟程度也与BTZ耐药相关。蛋白酶体成熟蛋白（POMP）作为分子伴侣参与了20S核心颗粒组装过程中β环的募集及其与α环的连接，后续则由蛋白酶体负责降解，故对于蛋白酶体从头合成十分重要[16,17,18]。Zhang等[19]和Li等[20]发现BTZ耐药细胞系中POMP表达上调，抑制其表达可逆转细胞耐药性，而BTZ敏感的亲代MM细胞系过表达POMP时则会诱导BTZ耐药。Li等[20]研究证实，POMP的过表达与其转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）表达上调相关。Nrf2结合并激活POMP编码基因的启动子区域，从而促进POMP过表达。因此，抑制Nrf2/POMP轴有望克服BTZ耐药。Zhang等[19]还发现miR-101可以在转录水平上干扰POMP的合成。但这两项研究均未提及在诱导耐药过程中是否出现PSMB5基因突变。
也有研究并不支持上述结论。考虑到S1不仅参与BTZ与β5亚基的结合，还参与了蛋白酶体对蛋白底物的作用，Franke等[10]将蛋白酶体亚基与suc-LLVY-AMC荧光蛋白底物相互作用并行电子结构预测分析证实，PSMB5基因点突变细胞的蛋白酶体与蛋白底物结合能力下降。他们认为β5亚基过表达可能是蛋白酶活性下降而出现的适应性结果，并非发生BTZ耐药的原因。
MM细胞内蛋白质稳态的维持有赖于内质网完备的结构和强大的功能。当蛋白质积累时，适度激活的ERS及UPR有助于促进蛋白质代谢，持久而强烈的ERS及UPR将诱导细胞凋亡[21]。BTZ的作用机制之一即通过抑制内质网相关性降解、触发过度持久的ERS、活化细胞凋亡信号通路从而诱导细胞凋亡。UPR由1个内质网分子伴侣（GRP78/Bip）和3个内质网膜上的应激感受器（IRE1α、PERK、ATF6）组成。其中，IRE1α/XBP-1通路活化与MM细胞对BTZ的敏感性有关[22]。XBP-1作为重要的转录因子，可以促进B淋巴细胞、前体浆母细胞分化成熟及分泌免疫球蛋白[23]。Chapman等[24]在2例BTZ难治MM患者样本中行基因检测，发现XBP-1-L1671和XBP-1-P326R点突变可导致XBP-1表达下降，进而导致BTZ耐药。Leung-Hagesteijn等[25]发现IRE1α/XBP-1表达沉默MM细胞的ERS反应强度低于XBP-1阳性MM细胞，对BTZ的敏感性亦明显下降。进一步对不同分化阶段及不同治疗阶段的MM细胞行流式细胞学检测发现，在B细胞分化早期阶段存在一类XBP-1阴性细胞亚群，因成熟阻滞及BTZ耐药而无法被杀灭，至终末阶段所占比例大幅增加，成为BTZ耐药的主要原因。Leung-Hagesteijn等[25]认为，由于这类细胞的XBP-1表达受抑、细胞成熟障碍、免疫球蛋白分泌水平明显降低，导致细胞内基础ERS水平较低；BTZ无法触发强烈的ERS，因而细胞得以存活并表现为BTZ耐药。鉴于上述研究，参与MM细胞分化成熟及免疫球蛋白分泌的相关机制可能为BTZ耐药的另一原因。另外，IRE1α抑制剂可能通过下调XBP-1的表达、抑制凋亡诱导而与BTZ拮抗[25]，这与既往研究认为的IRE1α抑制剂或可通过阻断UPR协助BTZ诱导过度的ERS来促进细胞凋亡[26]大相径庭。
病理状态下，细胞自噬作用处于低水平激活状态，与UPS作为细胞内蛋白质降解的两种途径共同维持细胞内物质代谢稳定状态的平衡。有研究显示，当UPS被抑制时，自噬作用将代偿性活性上调以维持细胞内蛋白质代谢平衡[27]。Amaravadi等[28]发现细胞自噬激活参与了MM细胞对BTZ的耐药，其机制可能为细胞内蛋白质的及时降解无法触发过度的ERS反应，表现为凋亡抵抗和BTZ耐药。鉴于以上结果，自噬通路调节剂与BTZ联合或可克服BTZ耐药并增强BTZ的细胞杀伤作用。Lamy等[29]利用RNA干扰文库筛选出MM细胞存活必需的基因caspase-10，caspase-10负责灭活清除过多的自噬诱导因子BCLAF1，维持适度的细胞自噬水平、避免细胞死亡。caspase-10抑制剂及其上游活化因子IRF4抑制剂可抑制caspase-10活性、激活过度自噬并触发细胞死亡。然而，由于caspase级联反应参与体内细胞凋亡及炎症反应等众多生理过程，caspase-10靶向药物需较高的特异性以免扰乱正常细胞代谢。另外，近来有研究发现组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）介导了泛素化蛋白聚集体向自噬小体的转运，将两个蛋白质降解系统联系起来，从而促进泛素化蛋白质通过细胞自噬途径降解[30]，这一发现为HDAC抑制剂联合BTZ治疗MM提供了理论基础。2016年初HDAC抑制剂panobinostat已被美国FDA批准用于难治复发MM的治疗，目前众多临床试验正在进行中，治疗效果值得期待。
MM细胞的存活及增殖离不开骨髓微环境的支持作用。骨髓基质细胞（BMSC）通过直接接触及间接分泌多种细胞因子促进细胞生长、增殖以及耐药。既往研究认为，BMSC来源的细胞外泌囊泡中含有多种miRNA和蛋白质，参与了细胞间的局部信号传递、影响MM细胞存活及增殖。Wang等[31]通过对5T33MM小鼠模型及MM患者标本中BMSC来源的外泌囊泡功能进行研究发现，BMSC来源的外泌囊泡还可以通过降低bcl-2家族促凋亡蛋白Bim表达以及抑制caspase-9、caspase-3及PARP的活化来减少细胞凋亡、降低BTZ敏感性。近年来多项试验发现，BMSC分泌的外泌囊泡中的多种miRNA进入MM细胞后将结合于mRNA 3'UPR，进而在转录水平对细胞周期进展、增殖、凋亡以及耐药等多个过程进行调节。目前研究较多的有miR-21、miR-15a/16、miR-33b等。miR-21在MM中表达上调，可能通过靶向Rho GTP酶家族RhoB的3'UTR末端、调控NF-κB途径来参与BMSC介导的细胞耐药[32]。miR-15a/16则在MM中表达减低，可能通过IL-6通路调节参与耐药的发生[33]。Zhang等[34]对204例MM患者外周血进行检测并行芯片分析，结果显示miR-16-5p、miR-15a-15p、miR-20a-5p及miR-17-5p（四者均表达下调）为调控信号网络核心成员，并在转录后水平协同参与了BTZ耐药的发生。未来血清游离外泌囊泡或miRNA水平或可成为预测BTZ耐药性的指标。
此外，胰岛素样生长因子-1/胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1/IGF-1R）表达上调也可能参与了BTZ耐药。BMSC分泌的IGF-1作为MM细胞的生长因子既可促进MM细胞生长[35]，也可下调Bim，从而抑制细胞凋亡[36]。Kuhn等[37]发现在BTZ耐药MM细胞系及患者组织样本中，细胞内IGF-1及IGF-1R表达均上调，抑制二者则可增加BTZ敏感性。另外，来自美国Dana-Farber癌症研究中心的研究认为，骨髓内环境为缺氧状态使得低氧诱导因子HIF-1α及其调节因子LDHA上调，二者通过调节细胞内糖代谢参与了残留MM细胞的存活，从而成为疾病复发的根源。HIF-1α或LDHA抑制剂可恢复BTZ敏感性[38]。
BTZ的耐药机制复杂且未完全明确，现有研究主要集中于以下几方面：蛋白酶基因突变、蛋白酶体蛋白的成熟与表达异常、UPR受抑与XBP-1表达下调、细胞自噬激活、肿瘤微环境的支持作用上调。BTZ作为MM治疗的一线用药，其耐药患者的后续用药策略为临床上一大挑战。在此背景下，克服MM对BTZ的耐药性将会显著改善这些患者的预后。由于可能有多种机制共同参与BTZ耐药，且不同患者间、同一患者的不同克隆及亚克隆间均存在极大异质性，因此可能需要多种药物协同作用。靶向UPS、调控MM细胞分化状态、抑制细胞自噬作用及阻断骨髓微环境的支持作用等有望从不同侧面克服BTZ耐药。
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