探讨慢性粒细胞白血病慢性期（CML-CP）患者骨髓单个核细胞中淋巴增强因子1（LEF-1）mRNA表达水平并分析其临床意义。
应用实时荧光定量聚合酶链反应测定38例CML-CP患者初诊和伊马替尼治疗后及20名正常对照骨髓单个核细胞的LEF-1 mRNA表达水平，分析其与伊马替尼治疗获得主要分子学反应（MMR）的关系。
38例CML-CP初诊患者LEF-1 mRNA中位相对表达水平为0.002 14（0.000 20~0.021 20），高于20名正常对照者[0.001 01（0.000 09~0.002 33）]（U=163.0，P<0.01）；38例患者经伊马替尼治疗后，25例获得MMR者LEF-1 mRNA中位相对表达水平为0.001 07（0.000 10~0.005 19），低于13例未获得MMR者[0.010 15（0.000 91~0.036 15）]（U=25.0，P<0.01），获得MMR组LEF-1 mRNA表达水平与正常对照组差异无统计学意义（U=201.0，P>0.05），未获得MMR组LEF-1 mRNA表达水平高于正常对照组（U=14.0，P<0.01）。口服伊马替尼治疗18个月时，初诊时LEF-1 mRNA高表达组MMR率为84.2 %（16/19），高于LEF-1 mRNA低表达组的47.4 %（9/19）（χ2=4.209，P<0.05）。25例获得MMR的患者中，初诊时LEF-1 mRNA高表达组达到MMR平均时间为（10.0±4.5）个月，短于LEF-1 mRNA低表达组的（14.6±3.8）个月（t=2.705，P<0.05）。
LEF-1可能参与CML的发生、发展，可反映肿瘤负荷，可能是预测伊马替尼疗效的指标之一。
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慢性粒细胞白血病慢性期（CML-CP）患者经酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗后可取得很好的分子生物学反应，但大多数患者需终身药物治疗[1]。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）可消除大多数患者体内的恶性克隆，但供体限制及移植后合并疾病等问题目前已经成为影响allo-HSCT疗效的瓶颈[2]。目前，对于何种治疗方案最可能达到无治疗缓解、何种理想状态下可停止药物治疗、有无预测疗效或疾病进展的细胞因子等已有大量研究。淋巴增强结合因子1（LEF-1）作为经典Wnt信号通路的核心调节因子，可调控与细胞周期和增殖相关的多种基因，且在早期造血和小鼠模型的白血病转化中发挥重要作用[3]。在多种血液恶性肿瘤中，如淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性淋巴细胞白血病（ALL）及急性髓系白血病（AML）中发现LEF-1高表达，其异常表达可能还与CLL的发生及CML的进展有关[4,5,6]。我们通过检测CML-CP患者初诊及口服伊马替尼18个月后的LEF-1表达情况，旨在进一步探讨其临床意义。
2008年1月至2017年1月我院血液内科住院及门诊收治CML-CP患者38例。诊断符合《血液学诊断及疗效标准》[7]，患者口服伊马替尼后均未出现因疗效不理想、不能耐受等而换用其他治疗方案，并能配合检查随访。其中男性23例、女性15例，年龄24~82岁，中位年龄62岁。以同期20名明确无血液系统疾病及肿瘤性疾病者为正常对照，包括男性9名，女性11名，年龄46~78岁，中位年龄56岁。标本采集均经患者及其家属知情同意后实施。38例CML-CP患者按常规剂量口服伊马替尼18个月，其间每3个月行血液细胞遗传学、分子生物学检查，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法对患者bcr-abl转录本水平，即BCR-ABLIS进行监测。18个月后根据其是否获得主要分子学反应（MMR）分为两组。
TRIzol（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶（美国Qiagen公司），SYBR Green RT-PCR Mix、核酸蛋白紫外分析仪、ABI7500 RT-PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。引物由上海生工公司合成，LEF-1、内参β-actin上、下游引物序列参见文献[8]。
标本制备：采集初诊、服用伊马替尼18个月后CML-CP患者及正常对照者骨髓4 ml，应用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用Ficoll密度梯度法分离骨髓单个核细胞。
RNA提取及cDNA合成：分离出的单个核细胞按TRIzol法提取总RNA，紫外分光光度仪测定吸光度（A）值，A260/A280比值为1.8~1.9，RNA浓度调整为500 ng/μl。按反转录试剂盒说明书建立反转录体系20 μl，合成cDNA。
LEF-1 mRNA表达水平检测：应用ABI7500 RT-PCR仪，参照文献[9]方法，采用两步法检测内参基因β-actin和目的基因LEF-1的相对表达量，实验重复3次。目的基因相对表达水平以2-△Ct进行相关数据的处理。
△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因
用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料进行方差齐性检验，符合正态分布者以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用t检验；不符合正态分布者以中位数（范围）表示，组间比较采用秩和检验。率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
20名正常对照者LEF-1 mRNA中位表达水平为0.001 01（0.000 09~0.002 33），38例CML患者初诊时LEF-1 mRNA中位表达水平为0.002 14（0.000 20~0.021 20），高于正常对照组，差异有统计学意义（U=163.0，P=0.000 2）（图1）。
伊马替尼治疗后获得MMR者25例、未获得MMR者13例，两组治疗前骨髓单个核细胞LEF-1 mRNA中位相对表达水平分别为0.001 07（0.000 10~0.005 19）、0.010 15（0.000 91~0.036 15）。获得MMR组LEF-1 mRNA表达水平低于未获得MMR组，差异有统计学意义（U=25.0，P<0.01），获得MMR组LEF-1 mRNA表达水平与正常对照组差异无统计学意义（U=201.0，P=0.267 8），未获得MMR组LEF-1 mRNA表达水平高于正常对照组（U=14.0，P<0.01）（图2）。
MMR：主要分子学反应
依据CML-CP患者口服伊马替尼治疗前骨髓LEF-1 mRNA表达水平，取其中位值0.002 14为界值，高于中位值者为高表达组（19例），低于中位值者为低表达组（19例）。口服伊马替尼18个月后，高表达组MMR率为84.2 %（16/19），低表达组为47.4 %（9/19），两组MMR率差异有统计学意义（χ2=4.209，P=0.040 2）。
口服伊马替尼后获MMR的25例CML-CP患者，以治疗前LEF-1中位相对表达水平0.001 07为界值，分为LEF-1 mRNA高表达组和低表达组，每组12例。LEF-1 mRNA高表达组达到MMR平均时间为（10.0±4.5）个月，短于LEF-1 mRNA低表达组的（14.6±3.8）个月，差异有统计学意义（t=2.705，P=0.012 9）。
逐渐演变而高度保守的Wnt信号通路作为调节增殖、分化及凋亡的关键路径已被人们熟知。LEF-1是Wnt/β-catenin信号通路的下游效应因子，可调控细胞的生长和分化。LEF-1表达失调可能导致多种疾病发生。研究证实Wnt信号通路在细胞发育和肿瘤形成中发挥关键作用，并可调控多种干细胞的自我更新、增殖及分化[5]，而其干细胞调节作用取决于其DNA结合能力[10]。
研究证实，LEF-1表达失控可参与白血病的转化[11]，并诱导AML、B-ALL的发生[3,12]。体外研究表明，LEF-1在AML1-ETO阳性白血病细胞系、CLL细胞和鼠T细胞淋巴瘤中具有促存活效应[6,11]。LEF-1的异常表达已在部分血液恶性肿瘤中被发现，包括急性早幼粒细胞白血病（APL）等[6,13,14]。Wang等[15]研究证实，各种类型白血病的LEF-1表达水平明显高于正常对照。我们的研究亦证实CML-CP患者初诊及治疗后未获得MMR者LEF-1 mRNA水平较正常对照均升高，与上述文献报道一致，提示LEF-1的过表达可能参与了CML的发生与发展，并可能发挥重要作用。
Edmaier等[16]研究显示造血干细胞LEF-l高表达，随细胞分化表达水平逐渐降低，并与造血干、祖细胞克隆形成能力密切相关。在健康个体中，LEF-1 mRNA表达水平在分化过程中的早幼粒细胞阶段达到最高值，并最终在粒细胞成熟后下调[17]。研究证实，淋巴细胞白血病的LEF-1表达水平高于髓系白血病和健康对照，而与慢性白血病相比，急性白血病中LEF-1的比例明显升高[15]，提示LEF-1异常表达可能参与各型白血病的发生。
LEF-1可影响肿瘤的恶性程度，其表达失控可能是肿瘤发展的重要步骤。LEF-1异常表达的原因和作用可能取决于细胞环境和分化阶段。Metzeler等[14]报道LEF-1在ALL中的表达比AML中更高，反映了在淋巴组织中LEF-1转录因子表达更高。有研究证实，LEF-l异常表达与CML的进展有关[4]。本研究结果显示，口服伊马替尼18个月后获得MMR的CML-CP患者LEF-1 mRNA表达水平与正常对照差异无统计学意义，而未获得MMR组LEF-1 mRNA表达水平较获得MMR者明显增高，提示LEF-1可反映肿瘤负荷及疗效，并可能在预测疾病进展等方面发挥一定作用。
已有研究显示，LEF-1高表达与APL和细胞遗传学正常AML的良好预后相关，而它是成年B前体ALL患者的不良预后标志[9,14]。在CLL中LEF-1表达的预后意义尚未彻底明确。LEF-1突变失活的T-ALL患者表现出良好的总生存趋势[18]。相反，在骨髓增生异常综合征患者中，疾病进展和预后不良与LEF-1的下调有关，提示髓系祖细胞成熟受损与LEF-1功能丧失有关[11,19]。本研究结果显示，LEF-1 mRNA高表达组MMR率高于低表达组，高表达组缓解时间短于低表达组，提示LEF-1可能成为评价或预测TKI治疗效果的指标之一，具体机制尚待进一步研究。应在今后工作中加大样本量的同时长期随访患者，以进一步明确LEF-1与CML预后间的关系。在白血病细胞中，LEF-1增强了细胞体外自我更新及存活能力，并在小鼠模型中显示出转化为白血病细胞的潜能[3,6,11]。LEF-1高表达的患者应该考虑应用新的分子靶向治疗，特别是Wnt通路的靶向治疗药物。
目前对于LEF1的复杂机制及其临床意义尚未详细阐明，而对CML-CP患者中LEF-1表达的初步研究可能有助于改进风险分层、预测疗效，以及为受LEF-1低表达影响的CML患者制订更好的治疗策略（如尽早进行造血干细胞移植等）。希望今后继续加大样本量，以早期识别其在CML耐药、疾病进展及复发、有效判断可试图停药的理想状态等方面的作用，同时能进一步观察LEF-1表达在CML生物学变化（如凋亡调节、CML发病机制等）中的作用，期待CML-CP患者的停药目标成为可能，并为白血病患者寻找新分子靶向治疗，特别是为靶向Wnt通路的药物等方面提供实验室依据。
无
