循环细胞游离DNA（cfDNA）是存在于循环血液中的游离DNA，包括来源于肿瘤细胞的DNA即循环肿瘤DNA（ctDNA）和正常组织细胞DNA。ctDNA是cfDNA中具有特异性的肿瘤DNA，cfDNA一定程度上可以反映肿瘤的状态，在肿瘤诊断、病情监测、疗效评估、预后和复发判断中具有重要作用，并且其作为一种简单有效的非侵入性"液体活组织检查"技术，具有潜在的临床应用价值。cfDNA分析作为一种新兴理念在B细胞肿瘤方面的研究报道逐渐增多，主要为通过cfDNA测序技术检测肿瘤特异基因突变、甲基化改变及微小残留病与疾病预后、复发、疗效监测和靶向治疗的关系。
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1948年Mandel和Métais第一次报道在人类的血液中存在细胞游离核酸，但直到1994年从血液肿瘤患者外周血中检测到突变的RAS基因片段，循环细胞游离DNA（cfDNA）在肿瘤研究中的意义才逐渐引起人们重视[1]。大量有关cfDNA的研究相继被报道，在非小细胞肺癌、乳腺癌和结直肠癌等实体瘤中cfDNA已经显示出其早期诊断、预后评估和复发监测中的临床价值。目前B细胞淋巴瘤的疗效、预后评估和复发判断主要依据CT或PET-CT，由于其具有放射性而无法进行多次重复扫描，限制了对该类疾病的动态监测，所以cfDNA这项无创且可重复性高的检测技术在B细胞淋巴瘤中具有潜在临床应用价值。文章从基因突变、甲基化改变、微小残留病（MRD）的检测和疗效监测来综述cfDNA在B细胞肿瘤中的研究进展。
目前，循环DNA释放的起源和具体机制尚不明确。已有大量研究显示，cfDNA可来源于原发灶肿瘤细胞、循环血液肿瘤细胞、微转移病灶及正常细胞等。cfDNA产生的可能机制包括细胞凋亡、坏死和分泌。在健康人的血浆中能检测到细胞游离DNA，表明循环DNA不只是来源于肿瘤细胞，正常细胞也能产生。通常认为健康人群cfDNA主要通过淋巴细胞和其他有核细胞的凋亡释放入血，最终被降解为180~200 bp片段；肿瘤在迅速生长过程中，有一部分肿瘤细胞因缺血缺氧发生坏死裂解，其中未降解部分DNA可能直接释放入血，产生的DNA片段更大，这表明cfDNA的产生可能与细胞凋亡和坏死有关[1]。研究发现循环肿瘤DNA（ctDNA）也存在于微囊泡/外泌体中，Lehmann等[2]通过凝胶电泳证明外泌体中包含的DNA量及片段大小与细胞凋亡和坏死无关，表明cfDNA的产生一部分可能与细胞主动分泌的颗粒如外泌体有关，但细胞分泌DNA的确切机制尚不清楚，还需进一步研究证实。
研究显示健康受试者cfDNA的平均浓度为30 ng/ml，而肿瘤患者血浆中cfDNA的平均浓度为180 ng/ml[1]。良性疾病、恶性疾病患者与健康者的血浆DNA浓度有重叠，只通过定量cfDNA浓度作为诊断标准没有很大价值，且缺乏特异性。Hohaus等[3]对弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和霍奇金淋巴瘤（HL）的研究显示cfDNA水平可能成为一个独立的预后标志物。此外，局部肿瘤的患者在经过外科手术治疗后，cfDNA水平可以降至正常范围，当游离DNA水平依旧很高时，常提示肿瘤细胞仍有残存，患者可能预后不良，这表明cfDNA水平与肿瘤患者预后有一定关系。在多发性骨髓瘤（MM）方面，Mithraprabhu等[4]研究证实，MM患者血浆中游离DNA含量亦明显高于对照组，但游离DNA水平与M蛋白、血清游离轻链和骨髓中骨髓瘤细胞数量无相关性。
通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测非编码基因组DNA（如ALU和LINE1重复序列）的长、短片段，其长片段与短片段的比值即为DNA完整性指数（DII），DII反映了cfDNA碎片化程度。最近研究显示cfDNA完整性是无远处转移乳腺癌诊断的一个潜在生物标志物，且cfDNA完整性与循环肿瘤细胞联合分析可提高无远处转移乳腺癌诊断的敏感性和特异性[5]。同样DII作为一个新的生物标志物，有望用于血液肿瘤的诊断和预后判定。Gao等[6]通过qPCR扩增β肌动蛋白基因（ACTB）的方法来检测血浆DNA，结果显示急性白血病患者血浆DNA完整性明显增高，其可能作为一个潜在生物标志物用于MRD的监测。Li等[7]研究证实DLBCL患者cfDNA浓度和DII相比于健康人显著升高（均P<0.000 1），且二者升高与DLBCL患者的预后不良相关，cfDNA浓度和DII升高与疾病晚期、乳酸脱氢酶（LDH）升高及更高的预后评分均相关，且DII升高是2年无进展生存（PFS）期的独立不良预后因素。
基因突变在健康人中发生率很低，而在肿瘤患者中发生率相对较高且具有特异性，检测肿瘤患者特异性突变基因有助于动态监测肿瘤的发生、发展。随着检测技术的不断改进，越来越多的肿瘤突变基因被发现，极大地推动了B细胞肿瘤患者cfDNA基因检测的临床应用。研究发现XPO1 E571K、EZH2 Y641N和MYD88 L265P基因突变对DLBCL患者的靶向治疗意义重大，且已有研究显示MYD88基因突变与靶向药物依鲁替尼有较好的疗效反应[8]。Camus等[9]研究显示运用数字PCR（dPCR）分析技术检测这3个体细胞突变基因敏感度较高，且dPCR在DLBCL患者cfDNA检测和体细胞突变量化上特异性较高。XPO1 E571K突变基因的检测可用于经典HL的诊断和MRD的检测，并明确了经典HL发病机制中XPO1基因突变所起的关键作用[10]。在大多数侵袭性B细胞淋巴瘤患者的外周血中，高通量二代测序（NGS）能检测并量化ctDNA编码免疫球蛋白受体的可变区-多样区-连接区（VDJ）序列，证实在DLBCL患者中检测ctDNA编码的克隆重组VDJ受体基因序列要早于影像学检查数月，且更具敏感性和特异性[11]。循环肿瘤DNA分析揭示了淋巴瘤患者临床结果的生物学因素，可指出不同遗传变异模式与临床病变的关联性，有助于患者的个体化治疗，强调在淋巴瘤患者的管理中无创性细胞游离DNA分析技术具有重要临床意义。
表观遗传学的改变在肿瘤发生、发展过程中起着重要作用。启动子CpG岛的甲基化可抑制抑癌基因功能，且低甲基化状态可导致基因组的不稳定[12]。在DLBCL患者血浆中能检测到cfDNA启动子的异常甲基化，且证实DAPK1基因异常甲基化是一个独立的预后标志物，可用于疾病疗效监测和预后评估[13]。Wedge等[14]研究显示，DLBCL患者DNA总体低甲基化可与其他表观遗传学异常包括DAPK1启动子高甲基化同时发生，肿瘤活组织检查DNA和血浆cfDNA出现总体低甲基化时常提示疾病预后不良，DNA总体低甲基化作为一个预后标志物具有潜在的临床应用价值。
MRD与肿瘤的预后及复发关系密切，MRD检测对肿瘤早期复发的监测至关重要，ctDNA是MRD的潜在标志物。众多研究表明，ctDNA在预测肿瘤复发上较临床常规影像学检查更早。临床上主要应用影像学监测MRD，仍有一些早期病变无法识别，且有一定放射性，无法实时连续监测，ctDNA具有无创、可重复性高和能早期监测的特点，在B细胞淋巴瘤中具有潜在临床应用价值。未来MRD检测研究可能会集中于有关B细胞淋巴瘤早期检测分子复发的诊断策略和经过标准一线治疗后MRD阳性患者维持治疗中靶向药物的临床试验研究[15]。
目前MM的诊断和预后分层主要由骨髓活组织检查来完成，但这一检查有创、可重复性不高，限制了MM的诊断、疗效监测、预后和复发的判断。MM是一种克隆异质性疾病，具有多病灶肿瘤浸润的特点，单个位点骨髓活组织检查理论上只提供了一个有限的克隆分子谱且可能无法捕获贯穿多个肿瘤位点的分子异质性，通过分析外周血cfDNA能给MM患者提供一个更综合的基因组全貌[16]。Mithraprabhu等[4]研究显示KRAS、NRAS、BRAF、TP53基因突变主要与RAS-MAPK通路有关，且单个部位骨髓活组织检查在全面捕获肿瘤基因组演变上受到明显限制，如果在骨髓活组织检查基础上辅以ctDNA分析，将有助于实时监测肿瘤动态并可能用于未来精准治疗的无创性指导。Kis等[17]通过液体活组织检查测序（LB-Seq）技术对KRAS、NRAS、BRAF、EGFR和PIK3CA全部基因蛋白编码外显子进行分析，表明cfDNA测序可能会代替骨髓系列取样用于患者的监测。关于VDJ重排，MM在疾病分布、血管分布、传播和细胞更新上都不同于B细胞淋巴瘤。Oberle等[18]研究显示30%的循环骨髓瘤细胞VDJ（cmc-VDJ）和细胞游离骨髓瘤VDJ（cfm-VDJ）不一致，说明cfm-VDJ重排可能不完全是由循环骨髓瘤细胞产生，一定程度上反映了肿瘤的整体负荷，且疾病治疗有效时cmc-VDJ和cfm-VDJ相比于M蛋白下降更为迅速，可能更适于直接评估疗效和MRD早期预测。有关VDJ重排的监测在MM中的应用价值仍需进一步研究证实。
多数骨髓瘤的复发与MRD相关，目前检测MM患者髓内MRD的方法有多参数流式细胞仪（MFC）、等位基因特异性寡核苷酸杂交法定量PCR技术（ASO-qPCR）和NGS；髓外MRD主要通过FDG PET-CT评估[19,20]。最近新兴的方法主要为cfDNA测序技术。在一项研究中，Sata等[21]通过定量血浆cfDNA的ASO-PCR产物，发现20例最初诊断为MM患者有18例，20例随访的MM患者有16例，其cfDNA序列与骨髓细胞序列相同，这些患者cfDNA浓度保持在一个相似的水平，且在治疗过程中有时会增加。基于这些数据，我们提出了检测cfDNA中的肿瘤VDJ重排序列可以反映患者骨髓瘤细胞的持续存在。但由于病例数不足，无法充分评估cfDNA用于MM患者MRD监测的潜在价值。随着分离提取cfDNA技术的快速发展和测序费用的下降，cfDNA、NGS联合骨髓检测有望用于MM患者MRD的评估。
黄琴等[22]研究显示，PET-CT在一定程度上可以反映肿瘤负荷，对MM的分期有指导意义，有助于制定个体化的治疗方案，但PET-CT具有较高的辐射，无法进行动态监测，对MM的疗效监测价值有限。相比于其他标志物，ctDNA的半衰期不到2 h，表明ctDNA能实时反映接受治疗的骨髓瘤患者的肿瘤负荷，且能在传统蛋白标志物和影像学技术之前检测肿瘤的动态改变[23]。Mithraprabhu等[4]研究发现一位MM患者在治疗有效时，两个已经明确的肿瘤克隆显著减少，当其病情复发且游离轻链急剧增加时，cfDNA又可检测出两个新的肿瘤克隆。这表明cfDNA作为一种微创的方法，可用于评估MM患者基因突变特性和治疗反应。在MM治疗过程中实时监测cfDNA肿瘤特异克隆突变基因将有助于患者疗效判断、药物选择和提示治疗干预时机。
越来越多研究证实作为一种特异、敏感、无创、可重复性高的方法，cfDNA测序技术检测肿瘤特异性基因突变、甲基化改变和MRD在B细胞肿瘤诊断、预后评估、复发判断、疗效监测及靶向治疗中具有潜在的临床应用价值。肿瘤特异DNA甲基化改变，循环肿瘤DNA编码免疫球蛋白受体VDJ重排序列与B细胞肿瘤分子分型和预后的关系亦将会被证实。虽然目前cfDNA检测在临床中广泛应用受到限制，但随着cfDNA检测技术的改进和基础实验研究的日益拓展，cfDNA联合其他肿瘤标志物及影像学的检查方法必将成为B细胞肿瘤患者监测的重要手段。
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