探讨miRNA-618（miR-618）对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响。
采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测miR-618在THP-1细胞和健康人外周血分离的单核细胞中的相对表达量。构建过表达miR-618质粒载体，以空载体作为阴性对照，将二者分别转染THP-1细胞，设定为miR-618过表达组和阴性对照组。采用CCK-8法和流式细胞术分别检测各组THP-1细胞增殖和凋亡情况。采用TargetScan软件预测miR-618靶基因，通过荧光素酶报告基因实验对其进行验证。采用蛋白质印迹法检测miR-618过表达组或阴性对照组的THP-1细胞和健康人外周血单核细胞中预测的miR-618靶基因蛋白表达的水平。
PCR结果显示，与健康人外周血分离的单核细胞相比，THP-1细胞中miR-618表达量低（P<0.05）。CCK-8法检测结果显示，与阴性对照组比较，miR-618过表达组THP-1细胞增殖能力降低（转染0、24、48、72 h细胞吸光度值：0.20±0.03比0.20±0.03、0.28±0.02比0.35±0.03、0.34±0.03比0.43±0.04、0.39±0.02比0.53±0.05，均P<0.05），细胞晚期凋亡率升高[（27.1±0.1）%比（14.9±0.1）%，t=2.13，P=0.03]。TargetScan软件预测miR-618靶基因为ARPP19。荧光素酶报告基因实验结果显示，转染野生型ARPP19基因质粒+ miR-618基因质粒组的THP-1细胞相对荧光素酶活性均高于空白对照组和转染野生型ARPP19基因质粒+ miR-618空载质粒组（0.170±0.003比0.100±0.004、0.100±0.001，均P<0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示，miR-618过表达组THP-1细胞ARPP19蛋白表达水平低于阴性对照组，而两组健康人外周血单核细胞中ARPP19蛋白表达水平相近。
miR-618可能通过抑制急性单核细胞白血病THP-1细胞ARPP19的表达而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。
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急性髓系白血病（AML）是由多种因素引起的造血系统恶性疾病，常伴随分化受阻、增殖异常、遗传学异常等[1]。尽管化疗后有40%~60% AML患者获得缓解，但仍有近60%的患者缓解后复发[2]。微RNA（miRNA）能调控细胞增殖、发育、分化和凋亡等[3]，其直接与mRNA上的顺式元件相互作用，对靶转录本的稳定性和转录翻译产生负向或正向的调节作用[4]。随着AML发病率及病死率逐年升高[2]，寻找调控新靶点成为AML诊断和治疗的新思路。我们前期分析筛选了一些在AML中差异表达的miRNA，本实验即对其中的miRNA-618（miR-618）对急性单核细胞白血病THP-1细胞的影响及可能机制进行研究，为AML患者的诊断、治疗提供思路。
急性单核细胞白血病细胞株THP-1购自上海中国科学院细胞库，分离的健康人外周血单核细胞取自山西省肿瘤医院样本库。LipoFiter转染试剂购自美国Life Technology公司，蛋白质印迹法相关抗体、荧光素酶报告基因实验试剂盒购自英国Abcam公司，miR-618模拟物购自北京瑞博泰克公司，胎牛血清、RPMI 1640培养液购自美国Invitrogen公司，RNA提取及反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，Annexin V和PI染色液购自北京索莱宝科技有限公司。miRNA相关质粒、突变型3'UTR ARPP19探针及聚合酶链反应（PCR）引物设计由上海生工生物工程公司完成。PTC-100 PCR仪、iQ5 Real Time PCR系统、电泳仪购自美国Bio-Rad公司，CytoFLEX C6流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，CO2培养箱购自美国Esco公司，-80 ℃冰柜、NANODROP 2000紫外分光光度计购自美国Thermo公司。
THP-1细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640高糖培养液，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。构建载有miR-618基因的质粒，以空载体质粒作为阴性对照，将二者分别转染THP-1细胞或健康人外周血单核细胞，设定为miR-618过表达组和阴性对照组。步骤如下：在转染前一天将细胞转到6孔板，用10%胎牛血清RPMI 1640培养液培养。细胞融合度达到75%~85%时，采用LipoFiter试剂转染，将细胞置于不含胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养36~48 h，更换为新鲜的含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。
采用TRIzol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测定260 nm与280 nm处吸光度（A）比值在1.80~2.00。应用反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。以GAPDH为内参基因。miR-618正向引物：5′-TG CTCTTGTTCACAGCCAAA-3′，反向引物：5′-GGTGAT GCCAATAACCCATC-3′；GAPDH正向引物：5′-ACCA CAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；反应体积为20 μl；反应条件：94 ℃ 10 s；56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共55个循环；94 ℃ 12 s，64~94 ℃生成熔解曲线。扩增设3个复孔。mRNA相对表达量以2-ΔΔCt计算。
取96孔板，加入各组细胞悬液100 μl/孔[（3~5）×103个细胞]，培养0、24、48、72 h，加入10 μl CCK-8试剂，培养3 h，用酶标仪测定450 nm处A值，以此值为细胞增殖水平。
将转染24~36 h的细胞重悬于100 μl磷酸盐缓冲液（PBS）中，分别加入荧光标记的Annexin V和PI染色液，室温避光15 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
采用TargetScan软件预测miR-618靶基因。转染前一天，将THP-1细胞或健康人外周血单核细胞按照2×105/孔接种于24孔板，用前述转染方法将载有miR-618基因或空载质粒和载有野生型或突变型预测基因3'UTR的质粒共转染THP-1细胞或健康人外周血单核细胞；以未经干预的细胞作为空白对照组，以转染载有突变型ARPP19基因质粒的细胞作为实验对照。转染36 h后收集细胞，PBS清洗2~3次，裂解细胞，将10 μl细胞裂解液加入96孔板中，加入荧光素酶底物，采用酶标仪检测萤火虫和海参荧光强度，以二者荧光强度比值为相对荧光素酶活性。实验重复3次。
用细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白样品，每孔样品20 μg；将蛋白转印到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶于室温下封闭2 h。加入兔抗ARPP19一抗，反应12 h，加入抗兔二抗，室温反应2 h。DAB染色，分析蛋白表达水平。
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，方差齐，以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
PCR检测结果显示，miR-618在健康人外周血单核细胞中相对表达量为0.93±0.02，在THP-1细胞中为0.36±0.08，差异有统计学意义（t=1.94，P=0.01）。
PCR检测结果显示，转染后，阴性对照组THP-1细胞miR-618基因相对表达量为1.00±0.04，转染miR-618模拟物的THP-1细胞miR-618相对表达量为1 034.00± 72.00，差异有统计学意义（t=2.91，P=0.001），表明THP-1细胞miR-618成功过表达。CCK-8法检测结果显示，转染后随着培养时间延长，miR-618过表达组THP-1细胞增殖水平较阴性对照组逐渐降低，转染24、48、72 h时，两组间细胞增殖水平差异均有统计学意义（均P<0.05），提示miR-618能抑制THP-1细胞增殖（表1）。
miRNA-618转染后培养不同时间急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖能力变化（
±s）
miRNA-618转染后培养不同时间急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖能力变化（±s）
| 组别 | 0 h | 24 h | 48 h | 72 h |
|---|---|---|---|---|
| 阴性对照组 | 0.20±0.03 | 0.35±0.03 | 0.43±0.04 | 0.53±0.05 |
| miRNA-618过表达组 | 0.20±0.03 | 0.28±0.02 | 0.34±0.03 | 0.39±0.02 |
| t值 | 2.35 | 2.76 | 2.71 | 2.73 |
| P值 | 0.78 | 0.08 | 0.04 | 0.03 |
注：两组样本数均为3；阴性对照组为空载体质粒转染的THP-1细胞；miRNA-618过表达组为转染载有miRNA-618基因质粒的THP-1细胞；细胞增殖能力以CCK-8法检测实验中450 nm处吸光度值表示
流式细胞术检测结果显示，转染24 h后，miR-618过表达组THP-1细胞晚期凋亡率高于阴性对照组[（27.1±0.1）%比（14.9±0.1）%]，差异有统计学意义（t=2.13，P=0.03），提示miR-618能够促进THP-1细胞的晚期凋亡（图1）。
注：阴性对照组为空载体质粒转染的THP-1细胞；miRNA-618过表达组为转染载有miRNA-618基因质粒的THP-1细胞
经TargetScan软件分析，预测miR-618靶基因为ARPP19（图2）。荧光素酶报告实验显示，在THP-1细胞中，转染载有野生型ARPP19基因质粒+载有miR-618基因质粒组的相对荧光素酶活性高于空白对照组和转染载有野生型ARPP19基因质粒+miR-618空载质粒组，差异有统计学意义（P=0.03）（表2），提示miR-618能结合ARPP19基因3'UTR，进而影响荧光活性；在健康人外周血单核细胞中，转染载有野生型ARPP19基因质粒+载有miR-618基因质粒组与空白对照组和转染载有野生型ARPP19基因质粒+miR-618空载质粒组间的相对荧光素酶活性差异均无统计学意义（均P>0.05）（表2）。无论THP-1细胞还是健康人外周血单核细胞，转染载有突变型ARPP19基因质粒+载有miR-618基因质粒组与空白对照组和转染载有突变型ARPP19基因质粒+miR-618空载质粒组间的相对荧光素酶活性差异均无统计学意义（均P>0.05）（表2），提示miR-618不能结合突变型ARPP19基因3'UTR，结合位点突变完全。
双荧光素酶报告基因实验检测急性单核细胞白血病THP-1细胞和健康人外周血单核细胞中转染miRNA-618与ARPP19基因后相对荧光素酶活性比较（
±s）
双荧光素酶报告基因实验检测急性单核细胞白血病THP-1细胞和健康人外周血单核细胞中转染miRNA-618与ARPP19基因后相对荧光素酶活性比较（±s）
| 组别 | 样本数 | 转染野生型ARPP19 3′UTR基因质粒 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 空白对照 | 转染miRNA-618空载质粒 | 转染载有miRNA-618质粒 | F值 | P值 | ||
| THP-1细胞组 | 3 | 0.100±0.004a | 0.100±0.001a | 0.170±0.003 | 3.00 | 0.03 |
| 健康人外周血单核细胞组 | 3 | 0.100±0.002 | 0.090±0.008 | 0.110±0.003 | 0.05 | 0.25 |
| 组别 | 样本数 | 转染突变型ARPP19 3′UTR基因质粒 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 空白对照 | 转染miRNA-618空载质粒 | 转染载有miRNA-618质粒 | F值 | P值 | ||
| THP-1细胞组 | 3 | 0.100±0.004 | 0.100±0.001 | 0.110±0.003 | 1.00 | 0.20 |
| 健康人外周血单核细胞组 | 3 | 0.090±0.002 | 0.090±0.002 | 0.100±0.001 | 0.22 | 0.18 |
注：空白对照为未经任何干预的细胞；与同一组中转染载有miRNA-618质粒细胞比较，aP<0.05
蛋白质印迹法检测结果显示，miR-618过表达组THP-1细胞ARPP19蛋白表达水平低于阴性对照组，而miR-618过表达组健康人外周血单核细胞ARPP19蛋白表达水平与阴性对照组相似（图3）。提示miR-618能负向调控THP-1细胞ARPP19表达。
注：1为转染空载质粒组；2为转染载有miRNA-618基因质粒组
在细胞多级、多向的分化过程中，细胞中也有一系列复杂而精细的调控事件发生，当正常造血分化中的调控发生异常时，常导致血液系统肿瘤的发生。有大量临床证据表明miRNA参与一些肿瘤的恶性转化，如miRNA-155p通过上调核因子κB（NF-κB）、bcl-2的表达抑制AML细胞凋亡[5]，而miRNA-34a/b在老年AML患者中低表达，且其高表达与患者良好的临床表现相关[6]。本实验通过PCR法检测发现，相对于健康人外周血单核细胞，THP-1细胞中miR-618的表达水平下调，我们推测miR-618可能作为抑癌基因在THP-1细胞中起调控作用。
研究发现，miR-618在胃癌中通过靶向环状RNA（circRNA）-CCDC66和释放bcl-2来抑制细胞凋亡[7]，通过下调肿瘤生长因子β2（TGF-β2）抑制胃癌细胞迁移[8]。而miR-618低表达与骨肉瘤患者的临床分期和远处转移相关。在体外，外源性miR-618表达显著抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡[9]。在前列腺癌中miR-618作为癌基因发挥作用，与前列腺癌病理状态相关[10]。在实体瘤中一些miRNA很可能是临床早期诊断、疗效判断的潜在标志物。为了进一步验证miR-618在AML细胞增殖及凋亡中的作用，我们在THP-1细胞中转染了miR-618基因，结果显示，过表达miR-618能抑制THP-1细胞的增殖，诱导细胞凋亡。本研究的结果与大部分关于miR-618低表达的研究结论一致，本研究中miR-618与其他基因间相互关系的内容尚鲜见报道。本研究显示，miR-618在THP-1细胞中表达下调，并参与了THP-1细胞增殖抑制和凋亡延缓过程，可能是通过抑制ARPP19基因表达实现的。ARPP19是ENSA家族的成员，已被证明能够促进肿瘤细胞的G2/M期转换和有丝分裂[11]。ARPP19过表达与许多肿瘤（如胶质瘤和肝细胞癌）的进展有关[12,13]，其在AML中能促进细胞的存活和myc、CDK1等癌相关蛋白的表达[14]。本实验通过研究miR-618对THP-1细胞的作用，为miR-618的临床靶向治疗提供了一定的体外实验依据。
总之，本研究结果表明，miR-618在THP-1细胞中低表达，并具有一定的功能，可能与AML的进展相关。我们后期将通过AML患者外周血细胞进一步对其进行研究，并继续探讨miR-618对THP-1细胞的影响。
所有作者均声明不存在利益冲突
