斯坦福大学医学院Domizi等^[2]通过质谱流式（CyTOF）分析了25个CD19 CAR-T输注前的样本，包括完全缓解（CR）患者（6例）、阴性复发患者（11例）或阳性复发患者（4例）和对CD19 CAR-T抵抗的患者（4例）。对于其中14例患者同时分析了CD19 CAR-T输注后的样本，包括CD19阴性复发（8例）、CD19阳性复发（2例）和对CD19 CAR-T抵抗（4例）。研究发现CD19阴性复发后白血病"非早期BI细胞"比例显著增加，表明CD19丢失与其B细胞特征的丢失有关。此外，在CAR-T回输前的样本中鉴定出类似于"非早期BI细胞"的CD19⁺ pro-B细胞亚群。因此推测这类细胞可能丢失CD19表达并逃避CD19 CAR-T杀伤，导致CD19阴性复发。与获得持续CR的患者相比，阴性复发患者的CD19⁺ pro-B细胞中的IKAROS水平较低，同时也发现CD19阴性复发的患者中白血病样pro-B细胞的IKZF1表达降低，而IKZF1可影响IKAROS表达并且与临床不良预后相关。进一步研究观察到CD19表达随着IKAROS下调而降低，IKAROS可调节与mRNA剪接相关基因，IKAROS-KDB细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）细胞更类似于髓系细胞，提示其B细胞特征的丢失。

华盛顿大学医学院Heard等^[3]利用全基因组文库筛选发现SPPL3是介导对CD19 CAR-T产生肿瘤内在抗性的关键分子。该研究首次发现蛋白翻译后修饰是介导抗原逃逸的新机制，SPPL3缺失直接通过修饰CD19糖基化导致CD19 CAR-T治疗失败。SPPL3缺失导致CD19蛋白中复杂聚糖的增加，SPPL3-KO细胞的表面染色显示CD19抗体结合这种高糖基化CD19蛋白的能力较低，并且与抗CD19 CAR（FMC63克隆）结合也降低，而SPPL3缺失对CD22糖基化或抗体结合没有影响。蛋白质模型显示，在CD19（N125）上糖基化的天冬酰胺残基与FMC63结合位点物理接近，表明在该位点添加复杂聚糖可能是造成CAR结合减弱的原因，从而导致T细胞活化障碍。

一项多中心回顾性研究结果显示^[4]，在接受CD19 CAR-T治疗的B-ALL患儿中，谱系转化发生率约2.9%。其中，23.7%存在KMT2A重排的患儿出现了谱系转换，表明KMT2Ar重排是CAR-T治疗后出现谱系转换的主要危险因素。因此，考虑到谱系转换的易感性，巩固性造血干细胞移植在KMT2A重排患者中的作用值得探讨。尽管该研究发现移植后患者只有1.4%出现继发性恶性肿瘤（SMN），但由于随访时间短，因果关系不明，有待进一步研究。

BCMA是通过γ分泌酶复合物的酶裂解介导从肿瘤细胞中脱落的，BCMA抗原丢失的肿瘤细胞可能会逃避CAR-T识别。在临床前模型中，已证明γ分泌酶小分子抑制剂（GSI）可增加BCMA在细胞表面的密度，降低可溶性BCMA的水平，并增强BCMA CAR-T在免疫缺陷小鼠模型中的抗肿瘤作用^[5]。Cowan等^[6]同时也完成了针对难治复发多发性骨髓瘤（MM）患者增加靶向BCMA的CAR-T剂量与GSI（JSMD194）联合的第一阶段临床试验。为评估GSI对浆细胞BCMA表达的影响，患者接受GSI（JSMD194）单药治疗，3次口服（25 mg），间隔48 h，在第5天获取骨髓样本，检测BCMA表达并与基线数据比较。在淋巴细胞清除化疗后，靶向BCMA的CAR-T以5×10⁷、15×10⁷、30×10⁷、45×10⁷ CAR-T的梯度剂量输注，并联合JSMD194治疗。该研究将GSI与BCMA CAR-T结合，结果证实这种结合是安全且可耐受的。GSI可增加浆细胞BCMA表面密度。在难治MM患者中观察到持续、快速的应答，其中很大一部分患者曾接受过BCMA靶向治疗和CAR-T治疗。BCMA CAR-T和GSI的结合可能增强抗肿瘤活性，即使是非常低剂量的BCMA CAR-T。

控制CAR的表达会影响CAR-T的适应性和抗肿瘤疗效，因此有研究者对具有不同CAR密度的CAR-T进行流式分选（CAR^High和CAR^Low）及功能和基因组分析^[7]。转录组学和表观遗传学分析揭示了CD4阳性和CD8阳性细胞亚群CAR^High和CAR^Low的差异，发现存在超过3 500个差异表达基因（CD4为2 086个，CD8为1 553个），与tonic信号、T细胞活化和增殖相关。CAR^High-T在未接触抗原时呈现出更强的tonic信号、活化和成熟表型，在抗原刺激活化后CAR^High-T中观察到细胞毒性和细胞因子产生增加，也呈现出更高比例的终末分化效应亚群及耗竭状态（PD1⁺ LAG3⁺ TIGIT⁺）。在针对难治复发MM患者的输注产品BCMA-HCB-01临床试验中（NCT04309981）也观察到这种现象，CAR^High-T呈现增强的细胞毒性。虽然在体内抗肿瘤疗效方面没有观察到显著差异，但CAR^Low-T表现出更高的持久性，表明CAR-T表面较高的CAR水平可能会降低长期疗效。单细胞转录组测序（scRNA-seq）分析表明CAR^High-T富集在活化的CD4⁺ T细胞和耗竭的CD8⁺ T细胞。CAR^High-T内NR4A1转录因子活性增加，可能解释了CAR^High-T功能差异的调节机制。为CTL019临床试验（NCT01029366、NCT01747486、NCT02640209）的回输产品打分时，观察到无应答患者的CAR^High-T富集。该研究揭示了CAR密度在CAR-T活性中的重要作用，在单个细胞水平对CAR密度所驱动调节作用的研究为关键调节因子的鉴定提供了重要工具，而调控关键调节因子有助于临床治疗。

Jackson等^[8]的一项研究对来自非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者的动态CAR-T（输注后的时间点：峰值扩张和收缩）进行scRNA-seq和蛋白质表面标记分析，以揭示低应答或无应答患者CAR-T进化并识别应答相关的生物标志物。低应答或无应答患者输注后的CD8⁺ CAR-T显示细胞毒性效应分子（GZMB、PRF1、GZMK、CCL5）及细胞毒性效应细胞分化相关转录因子（TOX、TOX2、NR4A2、NR4A3）显著上调，并且耗竭相关基因（FOS、JUN、NFKBIA等）显著富集。在蛋白质水平，与高应答者相比，低应答或无应答患者输注后的CD8⁺ CAR-T中TIGIT高表达并表现出耗竭特征（PD1、CTLA4、LAG3、TIM3高表达）。该研究表明在转录和蛋白质水平上，CAR-T向非增殖、成熟和耗竭状态分化，这种状态在低应答或无应答患者的CAR-T中富集。此外，免疫检查点TIGIT是CAR-T耗竭的潜在驱动因子，可作为一种新的预后生物标志物。

肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族蛋白的成员在先天/适应性免疫细胞相互协调中发挥关键作用，这些蛋白在免疫细胞生命周期中扮演着重要角色，包括启动、抑制和凋亡等。TNFR2是一种Ⅱ型跨膜蛋白，为肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，TNFR2已成为肿瘤免疫逃逸、肿瘤生长及检查点阻断抵抗性的潜在诱因。梅奥医学中心的一项研究发现，TNFR2在CD19 CAR-T早期激活和凋亡启动中发挥作用^[9]。该研究通过检测CAR-T上激活诱导的表面死亡受体和配体水平、探究CAR-T激活如何影响其适应性和临床反应，以及确定基于细胞的靶标以调节CAR-T细胞激活、凋亡和细胞毒性，最终提高CAR-T抗肿瘤活性。通过对ZUMA-1临床试验大B细胞淋巴瘤患者的CAR-T输注物进行流式细胞术检测，对获得CR患者（应答者）与未获得CR患者（无应答者）的CAR-T进行比较，持续刺激CD19 CAR-T后TNFR2持续升高，表明TNFR2介导远期抗原依赖性CAR-T功能障碍。进一步发现CAR刺激后，CD19 CAR-T上调TNFR2，但不上调TNFR1。虽然CD19 CAR-T的非特异性TCR激活保护它们免受激活诱导的细胞凋亡，但通过CAR的抗原特异性激活导致在刺激后2 h内启动细胞凋亡。TNFR2-KO CD19 CAR-T与对照CD19 CAR-T相比，早期活化表面标志物（CD25、CD69）下调，细胞凋亡减少及抗原特异性增殖和细胞毒性增强。在CD19阳性淋巴瘤的体内异种移植模型中，TNFR2-KO CD19 CAR-T扩增和抗肿瘤活性更强。

纽约西奈山伊坎医学院的一项研究采用质谱流式（39色）及scRNA-seq（10×Genomics）分别对11例接受BCMA CAR-T治疗的MM患者的外周血单个核细胞（PBMC）及6例患者骨髓单个核细胞（BMMC）进行检测及比较分析^[10]。外周血中CD8⁺ T细胞比例较高[反应良好者37%，反应不良（非常好的部分缓解以下反应）者11%，P=0.08]，CD14⁺单核细胞比例较低（30%比61%，P=0.28），NK细胞比例较低（2%比6%，P=0.08）。对PBMC的纵向分析显示，表型变化与CAR-T扩增相一致；CD14⁺单核细胞从第0周到第4周下降（40%比13%，P=0.04），而（非CAR）CD8⁺ T细胞从第0周到第4周增加（32%比43%，P=0.15）。非CD8⁺ CAR-T扩增的特征是向CD8阳性效应记忆表型（EM，CCR7^- CD45RA^-）分化（73%比92%，P=0.005）。在CAR-T复发时，骨髓微环境（BM）样本显示了这种转变的逆转：CD14⁺单核细胞水平保持不变或略有升高，而非CD8⁺ CAR-T在复发时下降。在肿瘤微环境中，CD8⁺ T细胞和CD14⁺单核细胞也表现出类似的趋势。纵向比较1例持续应答患者的治疗前后样本，观察到治疗后促炎趋化因子（CCL3、CCL4）、抗凋亡基因（MCL-1、FOSB、JUND）和NF-κB信号基因表达显著上调。此外，低反应者抗凋亡基因基线水平显著上调，提示存在一种新的介导逃逸的内在机制。靶向MCL-1/bcl-2轴可能通过增敏肿瘤细胞和增强CAR-T杀伤作用来增强CAR-T疗效。总之，强调了外周血、肿瘤微环境和肿瘤内部的变化可能共同影响CAR-T临床疗效。

此外，来自梅奥医学中心的一项研究也采用scRNA-seq检测了15例患者骨髓和血液样本中的骨髓瘤细胞和免疫细胞，深入探究早期复发（PD，定义为1年内复发）和持续反应（DR，定义为1年以上复发）的相关因素^[11]。其中，5例患者在CAR-T输注后DR，10例患者PD。在所有样本的CD138⁺细胞中均可见到BCMA的多模态表达，持续反应患者与早期复发患者相比，具有更高比例的BCMA CD138⁺细胞的趋势。通过Harmony整合对所有CD138⁺细胞进行聚类，发现了12个不同的细胞群，其中两个细胞群是DR患者所特有的，一个细胞群是PD患者所特有的，并且这3个细胞群中的标志基因富集在白细胞介素（IL）-15信号通路、BCR信号通路和原发性免疫缺陷信号通路中。与PD患者相比，DR患者外周血中CD16⁺单核细胞干扰素信号及分化为巨噬细胞的潜能降低，但骨髓中CD16⁺单核细胞抗氧化应激的线粒体基因、抗凋亡基因表达增高及更趋向于分化为M1型巨噬细胞。同时，DR患者在BM中CD8⁺ TCM细胞中参与细胞黏附和抗凋亡的基因表达增加，而CD4⁺ TCM细胞中与蛋白代谢相关的基因表达增加。该研究表明，BM和外周血免疫特征可能与持久的临床反应相关。

迄今为止，对CAR-T治疗有效性和安全性影响因素的研究主要集中在CAR-T产品特征和输注后症状，很大程度上忽略了患者回输前免疫特征在驱动治疗反应和不良反应方面的潜在作用。西雅图儿童研究所的一项研究假设免疫治疗前患者的全身免疫特征可以为临床治疗和干预提供信息，研究者从细胞因子释放综合征（CRS）和噬血细胞综合征（HPS）之间的临床表现重叠中汲取灵感，假设一个共同的病理生理学过程^[12]。HPS中的IL-18信号转导在异常T细胞功能中起致病作用，IL-18与肿瘤消退和进展也有相关性。回顾性队列研究（NCT02028455）显示，可基于细胞因子（IFN-γ-IL-18信号轴）和免疫细胞亚群（CD161⁺ IFN-γ⁺）为主的HPS样信号轴在CAR-T治疗后的前期和早期时间点对患者预后进行分层，预测不良临床预后的发生，如神经系统不良反应、无反应和复发。这项研究强调了在CAR-T治疗前研究患者全身免疫特征的必要性，可能是预测CAR-T治疗成败的关键，并有助于探索新的治疗方法和改善临床结局。