嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法是治疗血液系统肿瘤的有效方法，尤其在B细胞血液肿瘤中表现突出。虽然在临床中观察到较高的缓解率，但大部分患者在CAR-T治疗后仍会复发。随着CAR-T疗法在B细胞肿瘤和其他血液恶性肿瘤中的广泛应用，需要对其复发机制和治疗策略进行进一步的临床研究，以提升临床疗效，改善患者预后。
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CD19是针对B细胞肿瘤最常见的靶点，尽管嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法有着光明的前景，但仍有患者在治疗后复发或出现疾病进展，迫切需要对其复发机制进行探索研究，以提高CAR-T免疫疗法的临床应用价值。
CAR是一种人工重组蛋白，主要由抗原识别区、细胞外铰链区、跨膜区、细胞内信号传递域组成[1]。胞外域是从单克隆抗体中纯化的抗原靶向部分，与肿瘤抗原结合后触发细胞活化，介导细胞因子释放、细胞溶解脱颗粒和T细胞增殖，它决定了反应的质量、强度以及T细胞对肿瘤抗原反应的持续性[2]，跨膜区主要用于维持CAR结构，T细胞受体（TCR）构成激活T细胞所需的信号通路的细胞内信号传递域[2]。CAR-T扩增后可产生强大的免疫应答效应攻击破坏肿瘤。
2021年2月，美国食品药品管理局（FDA）批准第四款CAR-T药物lisocabtagene maraleucel（breyanzi）。liso-cel是具有4-1BB共刺激结构域并由CD4和CD8细胞亚群以确定的比例产生的抗CD19细胞构建体，用于治疗至少2种其他系统性治疗后无效或复发的大B细胞淋巴瘤（LBCL）成年患者[3]。2021年3月27日，FDA批准首款以BCMA为靶点的CAR-T药物idecabtagene vicleucel（abecma），用于接受4种以上药物后复发难治多发性骨髓瘤（MM）成年患者[4,5]。这是第一个用于复发难治MM的抗BCMA CAR-T药物，在KarMMa试验中，客观缓解率（ORR）达72%，28%的患者达完全缓解（CR）[4]。
随着患者接受治疗和随访时间的延长，CAR-T疗法局限性也逐渐显现出来。在ZUMA-1试验中评估了成年复发难治B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）[主要是弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）]患者使用axicabtagene-ciloleucel（axi-cel）的疗效，在JULIET试验中评估了tisageneleceluel的疗效，两项试验均显示相似的ORR（50%~80%）和CR率（40%~50%）[6,7]。约50%的ZUMA-1患者最初有反应，21%~35%的JULIET患者出现复发[8]。
CD19 CAR-T疗法在复发难治CD19阳性B细胞血液肿瘤中初步显示疗效，但并不是所有患者都有反应，且疗效不能持久，患者在达CR后早期复发的风险很高，多数患者在接受CAR-T治疗后1年内复发[9]，30%~50%的患者在接受CD19靶向CAR-T治疗且获缓解后会复发，无法维持长期疗效[10]，10%~20%的患者在接受CD19 CAR-T治疗后出现CD19阴性复发[11]。复发并不是针对CD19的药物所独有的，针对其他CAR靶点（如CD22）亦常见且反复出现，已成为影响其临床疗效的一个严重问题。
根据复发时间，将患者分为原发性耐药（原发性难治）、早期复发（输注后<3个月）和晚期复发（输注后≥3个月）[8]。CAR-T的持续性差和CD19抗原的逃逸或下调可能是患者治疗后复发的机制[11]。复发主要包括抗原阳性或阴性复发，抗原阳性复发是由于CAR-T持久性差导致对CAR-T治疗产生耐药性[9,12]，抗原阴性复发是由于缺乏靶向抗原（CD19抗原下调）而削弱CAR-T介导的识别和清除（CD19阴性克隆的形成）[13]。
早期复发通常以CD19阳性为特征，发生在成功诱导缓解后的前几个月内，CD19仍存在于B-ALL细胞表面，且可通过流式细胞术检测到[14]。CD19阳性复发通常与有限的CAR-T持续性[12]、CAR-T效价低、CAR-T住院患者反应低和短暂性B细胞再生障碍等因素有关[15]，因此CD19阳性复发很少发生在CAR-T持续期或B细胞再生障碍期。
其中CAR-T持续性差与抗原阳性复发高度相关，影响CAR-T在体内持久性的因素，包括CAR结构（细胞外结构、跨膜域和细胞内信号域以及附属结构）、激活信号（CAR和TCR信号）、体外培养方法（T细胞收集、纯化、激活、基因转导和细胞扩增）、表观遗传调控、肿瘤环境、CD4/CD8比例以及CAR-T分化和耗竭[12]。其中CAR-T的分化和耗竭被认为是中心环节，几乎所有因素最终都会导致细胞的分化和耗竭。体内外均发生的CAR-T耗竭会降低有效率，在体外扩增中，CAR-T分子自发聚集诱导持续信号导致CAR-T耗竭；输注后，反复抗原刺激使部分CAR-T进入效应器功能差、抑制性受体[如程序性死亡受体1（PD-1）、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（TIM-3）和淋巴细胞活化基因3（LAG-3）]持续表达的耗竭状态[12]。
另外，在CAR-T的制备过程中存在一些因素可能导致复发，如T细胞质量差，使用单链抗体、4-1BB共刺激区、病毒载体等[16]。临床上正在试验独立于CAR-T设计制造来提高持久性的策略，如在诱导缓解后定期给药T细胞抗原呈递细胞（T-APC）以激活抗CD19 CAR-T，从而确定复发刺激是否可使CAR-T重新活化和数量扩张，防止抗原阳性复发[9]。
由于缺乏CAR-T监测，早期复发通常以CD19阳性为特征，而CD19阴性在B-ALL患者接受抗CD19 CAR-T治疗后的晚期复发常见[3]。有研究表明，10%~20%的患者在接受CD19 CAR-T治疗后出现CD19阴性复发[11]。在ELIANA试验中，高达94%复发患者CD19抗原丢失[17]。CD19缺失导致尽管CAR-T持续存在，但肿瘤仍逃避CAR-T介导的识别和清除[3]。
与CAR-T治疗后CD19缺失相关的机制包括：白血病细胞中CD19基因的缺失或突变导致细胞表面定位缺失或功能失调蛋白的形成[18,19]，剪接因子SRSF3表达减少导致CD19 RNA剪接异常[18]，突变和选择性剪接产生细胞表面CD19修饰，CD19蛋白仍完整存在于细胞表面，但CAR细胞的scFv结构域所识别的位点已发生改变甚至被删除，还可导致CD19跨膜区截断或消失[19]；由转录因子PAX5和EBF1相关的前B细胞重编程引起的白血病谱系转换[20]，B-ALL肿瘤细胞可能发生表型转换并导致CD19表达下降或沉默，从而转化为CD19阴性髓细胞，CD19抗原不需要完全丢失，其下调足以逃避肿瘤杀伤效应[21]；另外在B-NHL中发现CD19抗原丢失时伴有PD-1表达增加以及CD19的替代剪接[3]。
对于有应答的患者，确认CAR-T的持续性和监测抗原丢失是预防复发的必要手段，对于初次治疗无反应或治疗后复发的血液肿瘤患者，可尝试接受二次CAR-T治疗。目前正在研究的一般策略包括：设计更有效的CAR-T、设计能分泌白细胞介素18（IL-18）等细胞因子的CAR-T、制造双CAR-T，以及去除免疫检查点分子以提高疗效的"敲除"CAR-T[22,23]。
对于CD19阳性复发者，应加强CAR-T持续性以降低复发风险[11]，比如构建4-1BB共刺激结构域和单独制造大量CD4阳性T细胞和中央记忆CD8阳性T细胞，然后以受控的1∶1比例预先给药[24]，通过改善其持久性有望减少CAR-T治疗后复发病例数量。
对部分患者而言，复发是与T细胞杀伤能力弱相关，一方面源于患者内在因素，如免疫缺陷基因存在，甚至有部分患者存在细胞因子释放综合征（CRS），T细胞对肿瘤细胞没有杀伤功能；另一方面继发因素导致T细胞质量和能力下降，例如前期治疗线数过多或接受过自体造血干细胞移植治疗等导致T细胞功能受损，所以提示患者在接受过多治疗前预存免疫细胞是有必要的，在患者状态稳定、仅接受一线治疗前后即保存免疫细胞，能够获得高质量的免疫细胞。第62届美国血液学会（ASH）年会上公布的数据显示：对一线治疗耐药的B细胞淋巴瘤即实施CAR-T能够获得极高的CR率。在至少1个月的随访时间里，CAR-T药物yescarta作为一线疗法，在治疗高危LBCL患者的Ⅱ期临床试验中获得较好结果，接受1次yescarta输注后，CR率达74%，ORR达85%[25]，且在中位随访时间为9.3个月时，70%获得缓解的患者仍处在持续反应中，在中位随访时间为9.5个月时，中位无进展生存期、总生存（OS）和缓解持续时间均尚未达到，这项试验数据为我们展示了yescarta作为更早线疗法的潜力。而在CAR-T（axi-cel）一线治疗高危LBCL的ZUMA-12研究中，数据表明抗CD19 CAR-T（axi-cel）一线治疗高危LBCL的CR率达80%，ORR达93%[25,26]，安全性可控，表明早期接受CAR-T治疗能让患者获益，也侧面提示患者治疗早期CAR-T功能和质量更为可靠。
目前CAR-T嵌合部分抗原有多种来源，包括鼠源、羊驼来源、人源、全人源等，如果鼠源失效但肿瘤细胞抗原仍在，则不能检测到CAR-T，此时理论上可以再次输注鼠源CAR-T，但存在由于前期鼠源成分致敏产生抗体（ADA）的可能，再次输注鼠源CAR-T后会导致清除加快而治疗无效，此时可以考虑换用不同来源的CAR-T，例如人源或全人源的CAR-T，可再次使患者达到缓解。Bukhari等[27]对46例3~69岁的复发难治B-ALL患者和未接受过CAR-T治疗的患者给予1×106/kg的剂量治疗，结果82.6%的患者在第30天获得CR或形态学CR而血细胞计数未完全恢复（CRi），对2例在输注鼠抗反转录病毒药物后复发的患者使用人源化构建体能够获CR，无事件生存率和12个月时的OS率分别为44%和67%。目前批准的抗逆转录病毒构建体利用鼠单链可变片段会导致抗反转录病毒T细胞清除和疾病复发风险增加，而利用人源化单链抗体（将人源化抗CD19单链抗体结构域整合到人CD8细胞膜上并与4-1BB共刺激结构域连接）可以降低疾病复发率[28]。
预防或治疗抗原丢失复发的策略包括：替代性给药抗原靶向CAR-T、顺序输注靶向不同抗原的CAR-T、输注双重/多重靶向不同抗原的CAR-T以及进一步调整CAR结构，以增强抗肿瘤活性，防止单个抗原阴性细胞的扩增克隆[29,30,31]。目前主要的解决方案是开发新的靶点，双靶向CD19和CD20 CAR-T已被提出用以克服CD19 CAR-T治疗后CD19阴性复发[29]，针对CD22的CAR-T以及双特异性CD19/CD22 CAR-T也已被设计出来[32]。Qin等[33]开发了针对CD19和CD22抗原的CAR-T，并证明了CD22-CD19双特异性CAR-T在动物模型中的有效性。抗CD22 CAR-T正在CD19阴性复发疾病患者中进行评估，其产品奥英妥珠单抗已获批用以治疗抗CD19 CAR-T治疗后阴性复发的患者[22]。
临床前研究发现，串联双特异性CD20-CD19 CAR-T不仅可以减轻靶向受体的下调，且至少可以减轻一种非靶向B细胞受体（即CD22）的下调[34]。双靶向CAR-T缓解了治疗失败时CD19的下调，同时靶向一种以上的B细胞抗原有可能降低由抗原阴性克隆逃逸介导的复发风险。
Strati和Neelapu[35]报道了肿瘤干扰素（IFN）信号转导和髓源性抑制细胞（MDSC）介导的免疫失调与LBCL的CAR-T抵抗有关，肿瘤高IFN信号与肿瘤相关巨噬细胞数量增加、全身炎症分子水平升高以及分别通过PD-1和LAG-3抑制T细胞的免疫检查点配体[如程序性死亡受体配体1（PD-L1）和MHC-Ⅱ类]在肿瘤细胞中的表达增加有关。在肿瘤特异性抗原刺激下，CAR-T PD-1的表达会显著上调，导致其抗肿瘤免疫反应削弱[36]。CAR-T可因慢性激活而耗尽，并在其细胞表面表达LAG-3、PD-1或TIM-3，从而降低再激活的概率[37]。研究表明，在表现出早期CAR-T抵抗的患者中，PD-L1和MHC-Ⅱ类分子的表达较高，CAR-T治疗无效的难治复发患者中PD-1均高表达[35]。
通过联合CAR-T与免疫检查点抑制剂以消除肿瘤微环境的免疫抑制来增强CAR-T的功能是一种新兴方法，早期结果表明联合治疗安全且毒性较低[2]。Chong等[38]报道了1例难治性DLBCL经抗CD19 CAR-T治疗无反应加用派姆单抗（人源化抗PD-1单克隆抗体）后获得缓解的病例，观察到应用派姆单抗前仅小部分CD19 CAR-T保持增殖，大部分CD19 CAR-T未增殖或仅低水平增殖，加用派姆单抗后CD19 CAR-T的增殖活性有了大幅度提高。因此，控制炎症反应和局部的肿瘤相关细胞，降低患者的肿瘤负荷，将对治疗大有裨益。
成年B-ALL患者中约60%会在CAR-T治疗后12个月复发，而儿童患者约有40%会在CAR-T治疗后复发，目前普遍认为CAR-T对于B-ALL并非最佳终极治疗措施[39]，>50%的高级别淋巴瘤患者在CAR-T治疗后也会出现疾病进展并需要额外治疗，可考虑在CAR-T治疗后2~3个月桥接同种allo-HSCT以提高临床治愈率。对于CAR-T治疗后复发风险较低的患者密切监测，无论对于哪一种机制复发下的B-ALL，序贯allo-HSCT可能是提高后续疗效的一种关键方法，输注同种异体CAR-T可实现高缓解率和低移植物抗宿主病发生率[40]。有研究在allo-HSCT前用CAR-T使患者微小残留病（MRD）转为阴性，后续序贯allo-HSCT能够使得患者无病生存率达（85.7±1.3）%[41]，因此建议对CAR-T治疗后达深度缓解的患者在3个月内使用allo-HSCT进行联合治疗，以最大限度地发挥其益处并将与毒性有关的死亡风险降到最低[42]。序贯allo-HSCT能否在所有患者中应用还需要进一步的临床试验证实。
对于CAR-T治疗后复发的患者，后续的治疗选择可能包括挽救性化疗、Bruton酪氨酸激酶抑制剂、免疫调节治疗和新药临床试验等。如果肿瘤是局部的，则可考虑放疗。
临床数据表明，大部分B细胞血液肿瘤患者在接受CAR-T治疗后会复发，因此迫切需要深入探索并研究其复发机制，从而制订相应的治疗方案，努力做到推广CAR-T疗法应用至更广泛的疾病的同时保证其有效率，最终达到提高患者治愈率的目的。
所有作者均声明不存在利益冲突
